熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）具有較高的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)水解力,和良好的嗜冷性,是生魚(yú)、肉類和乳制品中重要的革蘭氏陰性腐敗菌。群體感應(yīng)是一種細(xì)胞間的交流機(jī)制,參與毒力因子分泌、生物被膜形成、食品腐敗等的調(diào)控。現(xiàn)有研究表明希瓦氏菌、氣單胞菌、假單胞菌等革蘭氏陰性的致腐性與群體感應(yīng)密切相關(guān),然而,,P.fluuoescens中AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)分子信息及其調(diào)控生物被膜、腐敗和抗脅迫性的機(jī)制的研究較少。鑒于此,本研究以冷藏腐敗大黃魚(yú)中分離鑒定的優(yōu)勢(shì)腐敗菌P.fluorescensPF07為研究對(duì)象,采用生物報(bào)菌法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)PF07中的AHLs活性,利用基因框架測(cè)序技術(shù)預(yù)測(cè)PF07全基因組,并對(duì)獲得的LuxI和LuxR蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析;構(gòu)建并驗(yàn)證luxl和luxR基因缺失株,比較研究野生株和缺失株的生長(zhǎng)、生物被膜、致腐表型及抗脅迫性差異變化,評(píng)價(jià)luxI基因缺失株中外源添加C4-HSL的影響;基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)研究luxI和luxR基因缺失對(duì)P.fluorescens的基因表達(dá)及代謝通路的影響,旨在更加全面地了解致腐菌... 

【文章頁(yè)數(shù)】：112 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 生鮮食品中的腐敗菌
        1.1.1 食品腐敗菌類型
        1.1.2 熒光假單胞菌
    1.2 革蘭氏陰性菌與群體感應(yīng)
        1.2.1 群體感應(yīng)
        1.2.2 自誘導(dǎo)物、合成酶、受體及特異性
            1.2.2.1 自誘導(dǎo)物
            1.2.2.2 AHLs合成酶
            1.2.2.3 受體及特異性
        1.2.3 群體感應(yīng)與食品腐敗
        1.2.4 群體感應(yīng)與細(xì)菌生物被膜形成
        1.2.5 群體感應(yīng)與細(xì)菌抗脅迫性
    1.3 假單胞菌中的群體感應(yīng)
        1.3.1 銅綠假單胞菌中的群體感應(yīng)
        1.3.2 熒光假單胞菌中的群體感應(yīng)
        1.3.3 其他假單胞菌中的群體感應(yīng)
    1.4 本課題的研究目的、意義和內(nèi)容
第二章 熒光假單胞菌PF07基因組中LuxI/LuxR生物信息學(xué)分析
    2.1 前言
    2.2 材料與設(shè)備
        2.2.1 菌株及培養(yǎng)條件
        2.2.2 試劑
        2.2.3 主要儀器設(shè)備
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 報(bào)告菌法和LC/MS-MS檢測(cè)P.fluorescens PF07信號(hào)分子活性
            2.3.1.1 PF07生長(zhǎng)曲線測(cè)定
            2.3.1.2 報(bào)告菌法檢測(cè)PF07信號(hào)分子活性
            2.3.1.3 PF07信號(hào)分子提取
            2.3.1.4 LC/MS-MS檢測(cè)PF07信號(hào)分子
        2.3.2 菌體的培養(yǎng)與收集
        2.3.3 總DNA的提取及全基因組測(cè)序
        2.3.4 文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)檢
        2.3.5 P.fluorescens PF07基因組組分分析
        2.3.6 P.fluorescens PF07基因功能注釋
        2.3.7 P.fluorescens PF07 Lux/LuxR基因PCR擴(kuò)增
            2.3.7.1 DNA提取
            2.3.7.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增
        2.3.8 LuxI/LuxR同源性、保守位點(diǎn)分析及三維結(jié)構(gòu)模擬
    2.4 數(shù)據(jù)處理和分析
    2.5 結(jié)果分析
        2.5.1 報(bào)告菌法分析PF07信號(hào)分子活性
        2.5.2 LC/MS-MS檢測(cè)P.fluorescens PF07信號(hào)分子活性
        2.5.3 DNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序質(zhì)量評(píng)估
            2.5.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)概況
            2.5.3.2 基因組大小預(yù)測(cè)
            2.5.3.3 基因組組裝分析
        2.5.4 P.fluorescens PF07基因組組分分析
            2.5.4.1 編碼基因預(yù)測(cè)
            2.5.4.2 ncRNA預(yù)測(cè)
            2.5.4.3 Prophage預(yù)測(cè)
            2.5.4.4 CRISPRs預(yù)測(cè)
        2.5.5 P.fluorescens PF07基因功能分析
            2.5.5.1 P.fluorescens PF07蛋白質(zhì)COG聚類分析
            2.5.5.2 P.fluorescens PF07次級(jí)代謝基因簇分析
        2.5.6 PCR驗(yàn)證P.fluorescens PF07中LuxI與LuxR基因
        2.5.7 LuxI/LuxR進(jìn)化樹(shù)、保守位點(diǎn)分析及三維結(jié)構(gòu)模擬
    2.6 討論
第三章 LuxI/LuxR缺失對(duì)PF07生物被膜、致腐及抗脅迫力的影響
    3.1 前言
    3.2 材料與設(shè)備
        3.2.1 材料、菌株及培養(yǎng)條件
        3.2.2 試劑
        3.2.3 主要儀器設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 LuxI及LuxR缺失株的構(gòu)建
        3.3.2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失驗(yàn)證
            3.3.2.1 DNA提取
            3.3.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增
        3.3.3 報(bào)告菌法及LC-MS/MS檢測(cè)AHLs活性
        3.3.4 野生株和缺失株的生長(zhǎng)能力比較
        3.3.5 野生株和缺失株的生物被膜形成能力測(cè)定
            3.3.5.1 結(jié)晶紫法測(cè)定生物被膜量
            3.3.5.2 粘附能力測(cè)定
            3.3.5.3 水溶性胞外多糖含量檢測(cè)
            3.3.5.4 CLSM及SEM觀察粘附被膜
            3.3.5.5 泳動(dòng)能力測(cè)定
        3.3.6 野生株和缺失株在魚(yú)汁中腐敗能力測(cè)定
            3.3.6.1 滅菌魚(yú)汁制備和接種
            3.3.6.2 魚(yú)汁中生長(zhǎng)曲線測(cè)定
            3.3.6.3 胞外蛋白酶活性測(cè)定
            3.3.6.4 嗜鐵素相對(duì)含量測(cè)定
            3.3.6.5 TVB-N含量測(cè)定
        3.3.7 野生株和缺失株抗脅迫力的測(cè)定
    3.4 數(shù)據(jù)處理和分析
    3.5 結(jié)果分析
        3.5.1 △luxR和△luxI基因缺失驗(yàn)證
        3.5.2 生物報(bào)告菌法和LC-MS/MS檢測(cè)野生株和缺失株AHLs活性
        3.5.3 野生株和缺失株的生長(zhǎng)
        3.5.4 野生株和缺失株生物被膜形成比較
            3.5.4.1 生物被膜結(jié)晶紫定量比較
            3.5.4.2 粘附能力
            3.5.4.3 水溶性胞外多糖含量比較
            3.5.4.4 CLSM及SEM觀察被膜結(jié)構(gòu)差異
            3.5.4.5 泳動(dòng)能力比較
        3.5.5 野生株和缺失株抗脅迫力比較
        3.5.6 野生株和缺失株在魚(yú)汁中腐敗能力比較
            3.5.6.1 魚(yú)汁中生長(zhǎng)差異的比較
            3.5.6.2 胞外蛋白酶活性分析
            3.5.6.3 嗜鐵素相對(duì)含量比較
            3.5.6.4 TVB-N含量比較
    3.6 討論
第四章 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析LuxI/LuxR對(duì)PF07生理功能調(diào)控的機(jī)制
    4.1 前言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 主要試劑和培養(yǎng)基
        4.2.2 主要儀器
    4.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序
        4.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及樣品制備
        4.3.2 樣品總RNA提取純化及質(zhì)量檢測(cè)
        4.3.3 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序
        4.3.4 質(zhì)量控制與參考基因組比對(duì)分析
        4.3.5 基因表達(dá)水平分析及差異基因篩選
        4.3.6 差異基因篩選
        4.3.7 差異表達(dá)基因的GO富集
        4.3.8 差異表達(dá)基因的KEGG pathway富集
    4.4 熒光定量PCR驗(yàn)證
        4.4.1 樣品總RNA提取
        4.4.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄
        4.4.3 熒光定量PCR
    4.5 數(shù)據(jù)處理和分析
    4.6 結(jié)果與分析
        4.6.1 轉(zhuǎn)錄組reads質(zhì)量與統(tǒng)計(jì)分析
        4.6.2 差異基因表達(dá)分析
        4.6.3 差異基因聚類分析
        4.6.4 差異表達(dá)基因GO富集分析
        4.6.5 差異表達(dá)基因GO富集分析KEGG Pathway富集分析結(jié)果
        4.6.6 差異表達(dá)基因分類整理
            4.6.6.1 LuxI/LuxR敲除對(duì)P.fluorscens生物被膜相關(guān)基因的影響
            4.6.6.2 LuxI/LuxR敲除對(duì)P.fluorscens致腐性相關(guān)基因的影響
            4.6.6.3 LuxI/LuxR敲除對(duì)P.fluorscens抗脅迫能力相關(guān)基因的影響
        4.6.9 熒光定量PCR驗(yàn)證
            4.6.9.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增曲線及引物特異性分析
            4.6.9.2 基因表達(dá)量差異
        4.6.10 群體感應(yīng)LuxI/LuxR調(diào)控機(jī)制模擬圖
    4.7 討論
第五章 總結(jié)、創(chuàng)新點(diǎn)和展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄Ⅰ 轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異基因列表
附錄Ⅱ 攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大菱鲆熒光假單胞菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象及不同碳源培養(yǎng)下的腐敗特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,劉明爽,馬燕,勵(lì)建榮.  現(xiàn)代食品科技. 2015(12)
[2]冷藏大黃魚(yú)SSO希瓦氏菌致腐能力差異機(jī)制初探[J]. 趙二科,朱軍莉,馮立芳,施永清,勵(lì)建榮.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2015(02)
[3]GB T5009—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》理化部分簡(jiǎn)介[J]. 王竹天,蘭真,魯杰,蔣定國(guó).  中國(guó)食品衛(wèi)生雜志. 2005(03)
[4]中華人民共和國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口干制腸衣檢驗(yàn)方法[J].   商品與質(zhì)量. 1996(03)

博士論文
[1]食源假單胞菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的產(chǎn)生及其對(duì)食品腐敗的影響[D]. 綦國(guó)紅.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[2]3，5-DNBA降解菌和生物膜形成菌對(duì)硝基芳香烴廢水的生物強(qiáng)化處理研究[D]. 李蒙英.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]大黃魚(yú)源Shewanella baltica群體感應(yīng)LuxS蛋白及cyclo-（L-Pro-L-Leu）信號(hào)分子功能研究[D]. 葉曉鋒.浙江工商大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3721571