前期研究表明在擬南芥中通過增強MAN3基因表達,可以增強甘露聚糖水解酶的活性,使細胞壁中的甘露糖含量增多,從而增強植株對重金屬鎘的積累和耐受。已有文獻報道在辣椒中,MNB1的同源蛋白Ca MBL1的GNA結構域能夠與甘露糖特異性結合。擬南芥中MNB1蛋白中同樣存在GNA結構域,尚不清楚MNB1蛋白的GNA結構域是否與MAN3介導的甘露糖調節(jié)擬南芥鎘耐受的分子機制有關。因此本課題在前期研究已證明MNB1參與重金屬鎘脅迫響應調控基礎上,進一步對MNB1蛋白的GNA結構域調節(jié)擬南芥鎘耐受的分子機制進行研究,獲得了如下研究結果。1.為研究MNB1基因是否被鎘脅迫誘導,克隆了MNB1啟動子并構建了Pro MNB1-GUS轉基因植株。GUS染色分析表明,在鎘脅迫下,轉基因幼苗的根和葉的藍色明顯要比對照深,表明MNB1基因被鎘脅迫誘導。2.構建了一系列MNB1蛋白缺失表達載體并進行蛋白原核表達,同時進行甘露糖結合分析。發(fā)現(xiàn)只含有GNA結構域的MNB1蛋白能夠與甘露糖結合。從生化角度證明表明MNB1蛋白的GNA結構域是MNB1蛋白與甘露糖結合的關鍵結構域。3.構建了GNA結構域缺失的轉基因植株材料MN... 

【文章來源】：合肥工業(yè)大學安徽省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

擬南芥MNB1同源分析

第三章實驗結果與分析433.1.2MNB1的蛋白序列分析通過分析生物信息學相關數(shù)據(jù)和查閱相關文獻，對MNB1的蛋白序列進行分析，結果如圖3.2所示，該圖為MNB1的cDNA核苷酸序列和推導的編碼GNA相關凝集素蛋白的氨基酸序列。其中，上排為cDNA核苷酸，全長1368bp，下排為氨基酸序列，包含455個氨基酸；前端的黃色區(qū)域為SP信號肽序列，包含22個氨基酸；帶有紅色下劃線的區(qū)域為推定的GNA結構域，位于蛋白序列的第40個氨基酸到第191個氨基酸之間，包含151個氨基酸；紅色背景中的序列是推定的N-糖基化，末端的星號代表終止密碼子。根據(jù)此蛋白序列，我們后續(xù)構建了一系列MNB1蛋白GNA結構域缺失相關表達載體。圖3.2MNB1編碼蛋白的cDNA核苷酸序列和推定的氨基酸序列分析Fig3.2NucleotideanddeducedaminoacidsequencesanalysisofMNB1cDNAencodingprotein.3.2ProMNB1-GUS轉基因株系構建及表達分析3.2.1擬南芥MNB1基因啟動子的克隆為了進一步證明MNB1響應重金屬鎘脅迫，我們構建了ProMNB1-GUS轉基因株系。首先構建ProMNB1-GUS表達載體。在擬南芥TAIR網(wǎng)站（www.arabidopsis.org）上查詢到長度為2008bp的MNB1基因（At1g78830）的啟動子序列，作為目的片段，利用Primerpremier5.0軟件設計目的片段引物。提

合肥工業(yè)大學碩士論文44取野生型植株基因組DNA作為模板進行目的片段克攏克隆結果如圖3.3所示，M代表Marker，1代表目的片段，條帶大小與所選取的啟動子區(qū)域長度一致。圖3.3MNB1基因啟動子克隆Fig3.3CloningofpromoterofMNB1gene3.2.2目的片段與載體的雙酶切通過限制性內切酶KpnI/XhoI分別對克隆的目的片段和GUS空載進行雙酶切。本實驗所用GUS空載為改造后的pART27載體，載體上加入了KpnI及XhoI酶切位點。酶切后進行電泳檢測，電泳結果如圖3.4A所示，M1代表2kbMarker，1代表酶切后的目的片段，M2代表10kbMarker，2代表酶切后的載體。3.2.3ProMNB1-GUS重組載體的連接轉化酶切產物通過膠回收純化后，通過T4-DNALigase連接目的片段和載體，轉化到大腸桿菌，從抗性平板上挑取單菌落，小接于抗性LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)數(shù)小時后，進行菌落PCR。鑒定結果如圖3.4B所示，M代表Marker，隨機選取的12個菌落中，1、4、5、7、8、9、11、12號顯示出明亮條帶，選取1號和4號進行測序。測序結果表明，克隆獲得的序列正是擬南芥MNB1的啟動子的目標片段。AB圖3.4ProMNB1-GUS重組載體的酶切與大腸桿菌陽性菌株鑒定Fig3.4DigestionofProMNB1-GUSrecombinantvectorandidentificationofE.colipositivestrains

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