絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal型6（serine protease inhibitor Kazal-type 6,SPINK6）蛋白是醫(yī)學(xué)上的重要蛋白。為了高效制備具有生物活性的SPINK6蛋白,使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)SPINK6蛋白,經(jīng)過(guò)純化和酶切后測(cè)定了其生物活性,并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得產(chǎn)物的分子量為6 061.51 Da,通過(guò)此法成功制備獲得了重組SPINK6蛋白,并且重組SPINK6蛋白對(duì)激肽釋放酶相關(guān)肽酶5（kallikrein-related peptidase 5,KLK5）（K_i=3.02±0.26 nmol/L）和KLK14（K_i=1.85±0.05 nmol/L）有較強(qiáng)的抑制作用,具有生物活性。采用pE-SUMO3質(zhì)粒為載體,在菌體OD₆₀₀=0.4時(shí)加入1 mmol/L異丙基-β-D硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)3 h,重組SPINK6蛋白獲得最大表達(dá)量,1 L培養(yǎng)液中獲得重組SPINK6 3... 

【文章來(lái)源】：浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào). 2020,32(06)

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SPINK6基因的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增

為了重組表達(dá)SPINK6融合蛋白,我們將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明在約20千道爾頓(kilo Dalton,kDa)和24 kDa處有2條較強(qiáng)蛋白條帶(結(jié)果未顯示),陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置無(wú)蛋白條帶。隨后,我們對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行了2步分離純化。圖2(a)顯示了Ni2+-NTA純化的洗脫曲線(xiàn),隨著流動(dòng)相B的增加,在22～30 min獲得1個(gè)洗脫峰,在Ni2+-NTA純化過(guò)程中,大多數(shù)雜質(zhì)直接流穿,而SPINK6重組融合蛋白因帶有His標(biāo)簽而保留在柱上,因此分析該峰為SPINK6重組融合蛋白的洗脫峰。如圖2(b)顯示,出峰產(chǎn)物通過(guò)進(jìn)一步的制備RP8-HPLC純化,在38～42 min得到1個(gè)洗脫峰,反相高效液相色譜是通過(guò)物質(zhì)的不同極性將物質(zhì)分離,Ni2+-NTA純化后留下了SPINK6重組融合蛋白和咪唑等鹽類(lèi)物質(zhì),咪唑等鹽類(lèi)物質(zhì)極性較大先被洗脫下來(lái),而SPINK6重組融合蛋白極性較小,后被洗脫下來(lái),因此分析38～42 min的峰為SPINK6重組融合蛋白的洗脫峰。2.3 SPINK6重組融合蛋白的酶切和鑒定

2.3 SPINK6重組融合蛋白的酶切和鑒定為獲得SPINK6重組蛋白,4 ℃下酶切10 h時(shí)重組融合蛋白被完全消化,由圖3(a)可知產(chǎn)生約11 kDa和6 kDa的兩個(gè)條帶,分別對(duì)應(yīng)接頭蛋白和目的蛋白。進(jìn)一步對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行RP4-HPLC純化分析,洗脫峰進(jìn)行ESI-MS檢測(cè),其m/z值分布在758.73至1 516.20之間(結(jié)果未顯示)。通過(guò)最大熵反褶積得到了如圖3(b)所示的分子量圖譜,顯示酶切后的產(chǎn)物分子量為6 061.51 Da。該分子量同預(yù)期的SPINK6理論分子量6 067.83 Da相比,少了6.32 Da,這對(duì)應(yīng)6個(gè)H原子的質(zhì)量總和,這表明表達(dá)的SPINK6重組蛋白帶有3個(gè)二硫鍵[4]。


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