釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是重要的模式真核微生物,廣泛用于基礎(chǔ)研究和工業(yè)發(fā)酵�；贑RISPR/dCas9系統(tǒng)開發(fā)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法具有可編程、多重性和正交性等優(yōu)點,在釀酒酵母的基因調(diào)控、功能基因組學(xué)、代謝工程等研究領(lǐng)域具有巨大潛力。本文關(guān)注釀酒酵母中CRISPR/dCas9基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具的研究進展,闡述了不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域?qū)Cas9或gRNA活性的調(diào)節(jié),設(shè)計與優(yōu)化dCas9和gRNA表達的方法,影響CRISPR/dCas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率、特異性和通量的靶向性因素,最后總結(jié)了該工具在釀酒酵母代謝工程中的應(yīng)用,并對該技術(shù)的未來發(fā)展提出了展望。 

【文章來源】：生物技術(shù)通報. 2020,36(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：12 頁

【部分圖文】：

利用多條gRNA進行協(xié)同、多重或多模式轉(zhuǎn)錄調(diào)控

調(diào)節(jié)gRNA的轉(zhuǎn)錄水平也是優(yōu)化CRISPR/dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控性能的重要方法。首先,利用不同類型的天然啟動子可以用來調(diào)節(jié)gRNA的轉(zhuǎn)錄水平。與RNA聚合酶相對應(yīng),真核生物啟動子可分為I型(rRNA)、II型(mRNA)和III型(snoRNA、tRNA等)。由于II型啟動子會在gRNA的5"和3"端添加額外的核苷酸從而干擾其正常功能,因此一般利用III型啟動子驅(qū)動gRNA的表達,如PSNR52和PRPR1等[6,21,23]（表1）。然而，由于III型啟動子的轉(zhuǎn)錄本長度較短，為了提高gRNA設(shè)計和表達的靈活性，Gao等[52]通過在gRNA兩端分別融合錘頭型核酶（Hammerhead-type ribozymes）和HDV核酶（Hepatitis delta virus）在釀酒酵母細胞中實現(xiàn)了由II型PADH1啟動子驅(qū)動的gRNA的表達（表1）。這種含有核酸酶的g RNA稱為RGR(Ribozyme-flanked gRNA）�；谠撛O(shè)計，Deaner等[18]利用II型的PTEF1啟動子將gRNA的轉(zhuǎn)錄水平比III型的PSNR52啟動子提高了3.88倍，顯著提高了dCas9-VPR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制效率（gRNA靶點的位置效應(yīng)，見下文）。而Gander等[53]利用最小化PCYC1啟動子驅(qū)動RGR的轉(zhuǎn)錄，基于dCas9-Mxi1建立的非邏輯門顯示了最小的泄漏并具有數(shù)字響應(yīng)，為更加復(fù)雜的遺傳電路研究奠定了基礎(chǔ)。除組成型啟動子外，還可以改造天然的III型啟動子使其具有對環(huán)境因素變化響應(yīng)的能力，從而增強dCas9調(diào)控工具的可控性。例如，研究人員通過在III型PRPR1啟動子中整合Tet操縱子結(jié)合位點，實現(xiàn)無水四環(huán)素對gRNA的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，以及2-20倍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控動態(tài)范圍[21,38,42,54]。這些不同啟動子驅(qū)動的多種設(shè)計方案為gRNA的表達量、通量和對gRNA表達的控制提供了有力的工具和多樣的選擇。1.3 針對靶向性能的設(shè)計與優(yōu)化

與dCas9融合多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域或gRNA融合多個適配子的思路類似,靶向同一目的基因的多條gRNA能夠協(xié)同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄(圖3-A)。Farzadfard等[21]組合使用兩條gRNA時將轉(zhuǎn)錄抑制的效率從2倍提高到了7倍,Deaner等[18]同樣利用兩條gRNA提高了dCas9-VPR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制水平。此外,還可以通過在啟動子內(nèi)人工合成相同的靶序列,實現(xiàn)多條單一gRNA介導(dǎo)的協(xié)同調(diào)控。Farzadfard等[21]利用含有12個gRNA結(jié)合位點的合成型啟動子,將dCas9-VP64介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活提高了70倍,Gilbert等[23]利用含有7個Tet操縱子結(jié)合位點的合成型啟動子,將dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制提高了115倍。利用靶向多個目的基因的多條gRNA或scRNA可實現(xiàn)多重性(Multiplex)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖3-B)。Jensen等[38]利用dCas9與scRNA將Mxi1和VPR等轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域靶向類胡蘿卜素和三酰甘油生物合成途徑的多個基因,顯著增加了相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。Ferreira等[54]利用來自綠膿假單胞菌的核糖核酸內(nèi)切酶Csy4,實現(xiàn)了PRPR1啟動子驅(qū)動單條轉(zhuǎn)錄本中3個gRNA的轉(zhuǎn)錄和釋放,實現(xiàn)了同時對OLE1,HGM1和ACS1等多個基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外,基于CRISRP/dCas9工具中組成元件相互作用的特異性,可以設(shè)計彼此正交的gRNA,在同一細胞中對多個目標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn)不同模式的基因調(diào)控。例如,利用不同RNA適配子與其結(jié)合蛋白的特異性識別,Zalatan等[39]設(shè)計彼此正交、與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的scRNA序列(圖3-B),在同一菌株中對紫色桿菌素合成通路的不同分支的基因進行轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活,通過調(diào)控代謝流實現(xiàn)了不同產(chǎn)物的定向合成。利用不同Cas蛋白識別不同PAM序列的特點,Lian等[19]測試了不同來源的dCas蛋白和多種轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域的組合,構(gòu)建了基于dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152和SaCas9的釀酒酵母三相基因調(diào)控策略,稱為CRISPR-AID(Transcriptional Activation,transcriptional Interference,and gene Deletion)。作者設(shè)計了彼此正交、與不同Cas蛋白對應(yīng)的gRNA序列(圖3-C),在同一細胞中可以實現(xiàn)對多個目的基因進行轉(zhuǎn)錄抑制、轉(zhuǎn)錄激活、基因敲除等不同模式的調(diào)控。綜上,多重gRNA的設(shè)計與使用能夠提高單個靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力,實現(xiàn)多個靶基因的單向多重調(diào)控,還能夠利用正交性設(shè)計系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因的多重和多模式調(diào)控。通過增加可同時操作的基因靶點和調(diào)控模式,有助于從多個工程化改造靶點中快速找到最優(yōu)的調(diào)控策略及其組合,即利用組合式優(yōu)化為復(fù)雜基因線路、合成途徑和細胞代謝的設(shè)計和改造提供有力工具。


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