采用CRISPR-Cas9基因編輯技術,構(gòu)建G-蛋白偶聯(lián)受體41（gpr41）基因敲除的RAW264.7細胞系。利用慢病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建穩(wěn)定表達Cas9蛋白的巨噬細胞株。針對gpr41基因作用的功能區(qū)域,設計靶向gpr41基因的向?qū)NA（gRNA）,構(gòu)建pLenticrisprV2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,篩選出重組子測序驗證gRNA的有效性。鑒定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重組質(zhì)粒采用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染巨噬細胞系RAW264.7。篩選陽性單克隆細胞株,Western blot檢測gpr41基因的表達。測序結(jié)果證實pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;Western blot篩選出重組質(zhì)粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞13號單克隆株的GPR41蛋白不表達。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術成功構(gòu)建了gpr41基因敲除的巨噬細胞株,為研究gpr41基因在RAW264.7細胞中的作用機制奠定基礎。 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學學報. 2020,55(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

pLenticrisprV2質(zhì)粒酶切圖

選擇野生型細胞系和敲除型細胞系在蛋白水平上檢測GPR41表達情況。Western blot結(jié)果顯示,野生型細胞中GPR41蛋白正常表達,而敲除型細胞中檢測不到GPR41蛋白的表達(圖2)。圖2 GPR41蛋白水平檢測

GPR41蛋白水平檢測

【參考文獻】：
期刊論文
[1]巨噬細胞:一種理想的細胞骨架觀察教學材料[J]. 薛雅蓉,莊重,候冬霞,汪水娟.  中國細胞生物學學報. 2019(09)
[2]Short-chain fatty acids act as antiinflammatory mediators by regulating prostaglandin E2 and cytokines[J]. Mary Ann Cox,James Jackson,Michaela Stanton,Alberto Rojas-Triana,Loretta Bober,Maureen Laverty,Frederick Monsma,Galya Vassileva,Maureen Maguire,Eric Gustafson,Marvin Bayne,Daniel Lundell,Chung-Her Jenh.  World Journal of Gastroenterology. 2009(44)



本文編號：3339806