蛋白酶體（Proteasome）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑之一,其主要功能是降解受損傷或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。有研究報(bào)道酪蛋白激酶II（CKⅡ）磷酸化20S蛋白酶體的C8（α7）亞基對(duì)26S蛋白酶體的穩(wěn)定性有重要作用,但對(duì)于蛋白酶體活性的影響不甚清楚,本文旨在探討CKⅡ?qū)Φ鞍酌阁w活性的調(diào)節(jié)作用。方法:我們主要從細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩方面著手來(lái)研究CKⅡ?qū)Φ鞍酌阁w活性的調(diào)節(jié)作用,（1）探討CKⅡ?qū)?xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性的作用,首先用CKⅡ抑制劑（1uM DMAT、5 uM CX-4945、10 uM TBB）處理NRK細(xì)胞,16 h后收集細(xì)胞制備細(xì)胞核提取物,使用人工合成的熒光肽底物Suc-LLVY-AMC和Boc-LSTR-AMC分別測(cè)量不同核提取物中的胰凝乳蛋白酶樣和胰蛋白酶樣肽酶活性;CKⅡ抑制劑短時(shí)間處理NRK或293T細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞核提取物中的兩種肽酶活性;CKⅡ抑制劑（0.5/1 uM DMAT,0.25/0.5/1/5 uM CX-4945,1/5/10 uM TBB）分別處理NRK或293T細(xì)胞過(guò)夜,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白的含量;將GFP-CL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293... 

【文章來(lái)源】：電子科技大學(xué)四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線

圖 2-1 酪蛋白激酶 II 抑制劑處理 NRK 細(xì)胞。用倒置相差顯微鏡 10X 物鏡拍照，（a）DMSO 處理 NRK 細(xì)胞 16 h 后，細(xì)胞形態(tài)良好；（b）1 uM DMAT 處理 NRK細(xì)胞 16 h 后，細(xì)胞形態(tài)良好；（c）5 uM CX-4945 處理 NRK 細(xì)胞 16 h 后，細(xì)胞形態(tài)良好；（d）10 uM TBB 處理 NRK 細(xì)胞 16 h 后，細(xì)胞形態(tài)良好。細(xì)胞拍攝取照后，制備 NRK 細(xì)胞核提取物，使用人工合成的熒光肽底物Suc-LLVY-AMC和Boc-LSTR-AMC分別測(cè)量胰凝乳蛋白酶樣和胰蛋白酶樣肽酶活性。如圖 2-2 a 和 b 所示，相比對(duì)照組，給藥組（DMAT、CX-4945、TBB）熒光強(qiáng)度（FIU）明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中DMAT 和 CX-4945 組熒光強(qiáng)度（FIU）均高于 TBB 組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與 TBB 組相比，DMAT 和 CX-4945 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明 CKII 抑制劑長(zhǎng)時(shí)間處理 NRK 細(xì)胞能激活細(xì)胞核提取物內(nèi)胰凝乳蛋白酶樣和胰蛋白酶樣活性。當(dāng) NRK 細(xì)胞匯合度達(dá) 80%以上，對(duì)細(xì)胞給予 CKII 抑制劑 0.5 uM DMAT、0.5uM CX-4945、5 uM TBB 藥物刺激，分別處理 2h、4h、30 min 后，檢測(cè)核提取物內(nèi)的肽酶活性。如圖 2-2 c 和 d 所示，結(jié)果顯示三種抑制劑處理后熒光強(qiáng)度（FIU）

（c） （d）圖 2-2 酪蛋白激酶 II 抑制劑激活 NRK 細(xì)胞內(nèi)的肽酶活性。與對(duì)照組相比，1 uMDMAT、5 uM CX-4945、10 uM TBB 分別處理 NRK 細(xì)胞 16 h，（a）細(xì)胞核蛋白與 Suc-LLVY-AMC 底物反應(yīng)，熒光強(qiáng)度明顯升高；（b）細(xì)胞核蛋白與Boc-LSTR-AMC 底物反應(yīng)，熒光強(qiáng)度明顯升高；與對(duì)照組相比，0.5 uM DMAT處理 NRK 細(xì)胞 2 h，0.5 uM CX-4945 處理 NRK 細(xì)胞 4 h，5 uM TBB 處理 NRK細(xì)胞 30 min，（c）細(xì)胞核蛋白與 Suc-LLVY-AMC 底物反應(yīng)，熒光強(qiáng)度明顯升高；（d）細(xì)胞核蛋白與 Boc-LSTR-AMC 底物反應(yīng)，熒光強(qiáng)度明顯升高；熒光強(qiáng)度（FIU）反映了肽酶活性，Suc-LLVY-AMC 底物對(duì)應(yīng)胰凝乳蛋白酶樣活性，Boc-LSTR-AMC 底物對(duì)應(yīng)胰蛋白酶樣活性。（*P <0.05，**P <0.01，*** P<0.001，**** P <0.0001，n = 3）2.4.2 酪蛋白激酶 II 抑制劑激活 293T 細(xì)胞內(nèi)的肽酶活性用 CKII 抑制劑 0.5 uM DMAT、0.25 uM CX-4945、1 uM TBB 處理 293T 細(xì)胞，


本文編號(hào)：3304845