水稻既是重要的糧食作物也是單子葉植物生物學(xué)研究的模式材料,隨著水稻功能基因組學(xué)研究的深入及分子操作技術(shù)的成熟,有效解讀水稻內(nèi)源基因生物功能,進(jìn)而進(jìn)行有效的分子育種日益成為可能。細(xì)胞分裂素（cytokinin,CTK）是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程必不可少的激素成分,細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶（cytokinin oxidases/dehydrogenase,CKX）通過(guò)降解細(xì)胞分裂素,有效調(diào)控植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平,是細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中降解分支的關(guān)鍵酶。水稻全基因組中注釋了11個(gè)CKX基因,已有研究揭示了其中部分基因?qū)λ旧L(zhǎng)的調(diào)控作用,但因?yàn)槿狈γ鞔_的突變體材料,水稻OsCKX基因家族具體成員的生物功能所至有限。本文應(yīng)用CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a基因組編輯技術(shù),以日本晴為模式材料,針對(duì)OsCKX基因家族成員進(jìn)行定向敲除,創(chuàng)制OsCKX1^OsCKX11單基因及多基因定向敲除突變體材料,為系統(tǒng)研究OsCKX基因家族不同成員生物功能及有效進(jìn)行分子育種奠定基礎(chǔ)。本文主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.基于CRISPR-Cas9核酸酶編輯系統(tǒng)向?qū)NA（single g... 

【文章來(lái)源】：電子科技大學(xué)四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

OsCKXs基因家族定向敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)示意圖

基于 CRISPR-Cas9 基因編輯的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)針對(duì) OsCKX1~OsCKX11 各個(gè)基因分別設(shè)計(jì)兩個(gè)目標(biāo)基因靶位點(diǎn)，確保獲得足夠數(shù)目的理想突變體材料。CRISPR-Cas9 單基因定向敲除載體構(gòu)建完成后通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化獲得再生植株，利用 PCR-SSCP、PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)再生植株進(jìn)行檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)突變效率。從各個(gè)基因的中分別選擇兩個(gè)突變植株確定其基因型并種植收獲后代。3.2.1 CRISPR-Cas9 雙 sgRNA 定向敲除載體設(shè)計(jì)及構(gòu)建3.2.1.1 載體設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)基于骨架載體 pZHY988，針對(duì) OsCKX1~OsCKX11 設(shè)計(jì)雙位點(diǎn)靶向單基因的敲除載體。通過(guò) PCR 反應(yīng)擴(kuò)增獲得插入片段，包括酶切保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)、sgRNA1 及其 gRNAscaffold 部分、sgRNA2 及其 U6 啟動(dòng)子。插入片段和骨架載體中均存在 BsaI 酶切位點(diǎn)，經(jīng) BsaI 酶酶切使骨架載體的 ccdB（致死基因）表達(dá)框缺失，取而代之為 T4 連接酶連入的 sgRNA 表達(dá)單元，完成載體構(gòu)建。

第三章 結(jié)果與分析和下游引物，Cas9-Primer-F 和 Cas9-Primer-R 即（5’CATTGTGAATGTTTTGTTGGATC3’）和（5’TTCTAATAAACGCTCTTTTCTCT3’），正確構(gòu)建載體則擴(kuò)增片段大小為 951 bp，如圖 3-3（d）。挑選檢測(cè)正確的陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)用于質(zhì)粒提取，質(zhì)粒送于生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建 11 個(gè)定向敲除載體 pWY05~pWY15。


本文編號(hào)：3254904