旨為篩選并構(gòu)建II型內(nèi)含子編碼蛋白Mg²⁺結(jié)合位點突變體,驗證該位點突變對II型內(nèi)含子"歸巢"效率的影響。利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選關(guān)鍵位點,利用定點突變技術(shù)構(gòu)建突變體,利用Targetron及藍白斑計數(shù)法驗證其"歸巢"效率。結(jié)果顯示,篩選到D308和D309兩個位點是II型內(nèi)含子編碼蛋白Mg²⁺結(jié)合的核心催化位點,并成功構(gòu)建該位點的三種突變體,包括兩個單點突變體（D308A和D309A）和一個雙點突變體（D308A/D309A）,大腸桿菌體內(nèi)實驗結(jié)果表明,三種突變體均完全失活了II型內(nèi)含子的"歸巢"功能。證實了II型內(nèi)含子編碼蛋白Mg²⁺結(jié)合位點是其發(fā)揮功能的核心催化位點。 

【文章來源】：生物技術(shù)通報. 2020,36(10)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

II型內(nèi)含子“歸巢”示意圖

為了驗證D308A、D309A、D308A/D309A突變對II型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響,將突變型IEP蛋白取代Targetron載體上的野生型IEP蛋白,構(gòu)建Mg2+結(jié)合位點突變的Targetron載體,同時以野生型Targetron載體作為對照,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)后涂布含有Xgal和IPTG的平板,過夜培養(yǎng)后通過菌落PCR(圖4)及藍白斑篩選(圖5-A),分析IEP蛋白Mg2+結(jié)合位點突變對Ⅱ型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響。研究結(jié)果表明,野生型Ⅱ型內(nèi)含子在大腸桿菌中針對lacZ-635s位點的“歸巢”效率為90.845%±6.792%,針對lacZ-1063a位點的“歸巢”效率為92.582%±2.898%[24];然而,將IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點(D308A、D309A、D308A/D309A)突變后,平板均為藍斑,菌落PCR驗證其靶位點也沒有任何內(nèi)含子插入,其“歸巢”效率均降低為0%(圖4-5)。此結(jié)果表明,IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點突變,失活了IEP蛋白的反轉(zhuǎn)錄功能,使Ⅱ型內(nèi)含子不能以內(nèi)含子RNA為模板合成cDNA而插入到DNA靶位點,即II型內(nèi)含子完全失去其“歸巢”功能。圖3 IEP蛋白生物信息學(xué)分析

IEP蛋白生物信息學(xué)分析

【參考文獻】：
期刊論文
[1]L1.LtrB內(nèi)含子編碼蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵催化位點分析及功能驗證[J]. 陳相好,張崢嶸,劉芳,陳崢宏,洪偉,綦廷娜,谷俊瑩,崔古貞.  微生物學(xué)報. 2019(12)
[2]高效嚴謹型大腸桿菌Targetron基因打靶系統(tǒng)的構(gòu)建[J]. 陳相好,劉芳,王彩霞,陳崢宏,洪偉,蔡夢迪,張崢嶸,綦廷娜,廖永慧,谷俊瑩,崔古貞.  生物技術(shù)通報. 2019(06)



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