隨著基因組學、生物信息學和蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展,大量未知蛋白質(zhì)的功能需要鑒定。融合蛋白標簽技術的發(fā)展,為研究蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)定位、相互作用和分離純化等提供了有效的工具。目前已有許多融合標簽系統(tǒng)在重組蛋白質(zhì)表達中得到廣泛應用。但仍存在操作程序復雜、成本昂貴和周期長等問題。一個理想的蛋白質(zhì)標簽是由基因編碼,在體內(nèi)和體外均能起作用,且提供一個敏感的分析信號,并不影響甚至促進目的蛋白質(zhì)的可溶性表達。在原核表達系統(tǒng)中,未經(jīng)改造的綠色熒光蛋白（wild type GFP,wtGFP）的表達產(chǎn)物大部分是不可溶的,即易形成包涵體。其作為一種報告基因,以其獨特的優(yōu)勢廣泛用于基因的表達與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細胞的分離與純化等研究領域。其折疊易受溫度影響,發(fā)光較弱,應用到某些多層植物細胞中不容易觀察。后期改造的增強型GFP（enhanced GFP,eGFP）熒光強度得到提高,但在原核表達系統(tǒng)中其產(chǎn)物也只是少部分可溶。其若作為應用標簽,不利于可溶性重組蛋白結構、功能和生化性質(zhì)的研究。本實驗以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）為研... 

【文章來源】：聊城大學山東省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
前言
第一章 緒論
    1.1 大腸桿菌基因表達系統(tǒng)
        1.1.1 表達宿主菌
        1.1.2 表達載體
    1.2 外源蛋白可溶性表達策略
        1.2.1 寄主菌株的選擇
        1.2.2 載體的選擇
        1.2.3 改變培養(yǎng)參數(shù)
        1.2.4 密碼子優(yōu)化
    1.3 綠色熒光蛋白
        1.3.1 GFP的來源、結構及發(fā)光機制
        1.3.2 突變GFP功能研究現(xiàn)狀
        1.3.3 GFP在生物領域的最新應用進展
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設備
        2.1.4 PCR引物、目的基因合成和測序
        2.1.5 培養(yǎng)基與主要溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌DH5α感受態(tài)
        2.2.2 目的片段的獲取方法
        2.2.3 酶切反應
        2.2.4 純化目的片段與載體
        2.2.5 連接反應
        2.2.6 質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
        2.2.7 菌落PCR快速篩選與鑒定重組子
        2.2.8 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.9 瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.2.10 表達載體pET-eGFP和 p ET-sGFP的構建
        2.2.11 熒光強度測定
        2.2.12 誘導蛋白表達
        2.2.13 SDS-PAGE電泳
        2.2.14 sGFP濃度與其熒光強度之間的對應關系
第三章 結果與分析
    3.1 表達載體的構建
        3.1.1 擴增基因eGFP
        3.1.2 重組質(zhì)粒p ET-eGFP、pET-sGFP的鑒定
    3.2 熒光蛋白誘導表達分析
        3.2.1 最佳IPTG誘導濃度鑒定
        3.2.2 熒光強度分析
    3.3 熒光蛋白SGFP的可溶性驗證
    3.4 SGFP標準曲線
第四章 討論與展望
    4.1 討論
    4.2 展望
參考文獻
附錄
    縮略語表
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3205010