背景:真核細(xì)胞依賴其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)高效地完成復(fù)雜的生化反應(yīng)。盡管目前有一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離技術(shù),但卻缺乏評估這些分離技術(shù)的簡單、有效方法。目的:構(gòu)建可以用來檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離效率的釀酒酵母菌株。方法:通過傳統(tǒng)的分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)方法以釀酒酵母為背景構(gòu)建了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離效率評估菌株,并進(jìn)行可行性檢測。首先,將酵母各細(xì)胞器、自噬體及質(zhì)膜的標(biāo)記蛋白進(jìn)行分組,用不同的蛋白標(biāo)簽分別標(biāo)記每組蛋白。然后,以標(biāo)記蛋白-GFP/RFP作為對照組通過免疫熒光法檢測蛋白標(biāo)簽對標(biāo)記蛋白的亞細(xì)胞定位是否有影響。最后,通過非連續(xù)性密度梯度離心驗(yàn)證該檢測菌株能否用來檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離效率。結(jié)果:成功構(gòu)建了酵母亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離效率評估菌株,該菌株標(biāo)記了大多數(shù)酵母細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。掛標(biāo)簽的標(biāo)記蛋白仍然定位在各自標(biāo)記蛋白對應(yīng)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。非連續(xù)性密度梯度離心后,酵母各個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的標(biāo)記蛋白均可以被檢測到。結(jié)論:該酵母亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離效率評估菌株是檢測各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離結(jié)果的方便工具,對今后釀酒酵母細(xì)胞生物學(xué)的研究有潛在的應(yīng)用價值。 

【文章來源】：中國生物工程雜志. 2020,40(10)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：14 頁

【部分圖文】：

YOT027 Western blot檢測結(jié)果圖

除了以上這些有特定形態(tài)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)外，其他細(xì)胞器的標(biāo)記蛋白同樣也被檢測。與脂代謝有關(guān)的細(xì)胞器過氧化物酶體和脂滴，他們掛標(biāo)簽的標(biāo)記蛋白(Pex3-4myc,Erg6-2flag)分別與它們熒光蛋白標(biāo)記的蛋白(Pex3-Du Dre,Erg6-m Cherry)共定位(圖2f，圖2g)。早高爾基體、晚高爾基體及晚內(nèi)體的免疫熒光結(jié)果與上述相同:Anp1/Chs5/Snf7-4v5與Anp1/Chs5/Snf7-m Cherry均共定位(圖2h，圖2i，圖2j)。Atg8是自噬體的標(biāo)記蛋白[20],GFP-Atg8與9vsv-Atg8共定位且與GFP-Atg8單獨(dú)的熒光信號一致(圖2k)。綜上所述，本文中掛標(biāo)簽的各標(biāo)記蛋白的亞細(xì)胞定位沒有改變。圖2 免疫熒光與熒光蛋白共定位圖

免疫熒光與熒光蛋白共定位圖


本文編號：3134283