嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是重要益生菌,其功能開發(fā)及應用倍受關注。前期研究發(fā)現(xiàn),嗜酸乳桿菌GIM 1.208對刺梨果汁有較好的發(fā)酵品質特性,特別是產β-葡萄糖苷酶活性顯著,對刺梨黃酮苷元——槲皮素有明顯釋放功能,但相關機制尚不清楚。因此,本研究選用嗜酸乳桿菌GIM 1.208為發(fā)酵菌株,首先對刺梨發(fā)酵產酶培養(yǎng)基及發(fā)酵產酶條件進行優(yōu)化,進而利用分子生物學法探究蛋白質的理化性質及其一、二級結構等信息。同時,利用基因克隆技術擴增目的基因片段對其進行異源表達、純化,并利用圓二色譜法探究其二級結構。此外,對嗜酸乳桿菌GIM 1.208產β-葡萄糖苷酶與重組β-葡萄糖苷酶的酶學性質進行了初步比較分析。最后,采用熒光光譜、紫外吸收光譜及同步熒光光譜法,探究槲皮素糖苷底物蘆丁(Rut)和異槲皮素(Iso)與重組β-葡萄糖苷酶的結合方式,Rut和Iso對β-葡萄糖苷酶的淬滅作用機制,以及二者對該蛋白構象變化的影響。具體內容及結果如下:1、嗜酸乳桿菌GIM1.208產β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件研究探究碳源、誘導物和初始pH單因素試驗,進而進行L_9(3~4)正交試驗優(yōu)化嗜酸乳桿菌發(fā)酵產酶培養(yǎng)基。結果表明:影響嗜酸乳桿菌GIM 1.208產β-葡萄糖苷酶的主次順序為:誘導物碳源初始pH值,最佳發(fā)酵產酶培養(yǎng)基為:葡萄糖3%(v/w)、羧甲基纖維素鈉0.4%(v/w)、初始pH值為5.5,得到的酶活為11.684(U/mL.min),較未優(yōu)化前提高了17.20%。通過發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、料液比、接種量單因素試驗,從中篩選影響嗜酸乳桿菌發(fā)酵產酶的顯著因素,并用Box-Behnken試驗優(yōu)化發(fā)酵產酶條件。結果表明:發(fā)酵溫度、料液比和接種量對嗜酸乳桿菌產β-葡萄糖苷酶影響顯著(P0.05),最佳發(fā)酵產酶條件為:葡萄糖3.0%(v/w),羧甲基纖維素鈉0.4%(v/w),初始pH值為5.5,發(fā)酵溫度31℃,發(fā)酵時間24 h,接種量為2.5%(v/w),料液比為1:4(v/v),發(fā)酵所得酶活為16.8046 U/mL.min,較未優(yōu)化前提高了12.06%。通過驗證預測模型,實測值與理論值相差0.08%,該模型能夠真實反應嗜酸乳桿菌產β-葡萄糖苷酶的情況。2、生物信息學法探究β-葡萄糖苷酶的結構特性(1)β-葡萄糖苷酶的編碼基因序列分析通過基因克隆技術,得到β-葡萄糖苷酶的編碼基因序列并對其進行序列分析。結果表明:β-葡萄糖苷酶的編碼基因序列為1278 bp,由426個氨基酸組成,其中Asp(D)和Lys(K)在該編碼氨基酸序列中使用頻率最高,分別為8.5%和8%,其次是Iie(L)和Gly(G)分別為7.7%和6.6%,His(H)使用頻率最低,為0.7%。(2)β-葡萄糖苷酶的理化性質分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線分析工具,對編碼β-葡萄糖苷酶的核酸序列進行理化性質分析。結果表明:β-葡萄糖苷酶的總親水性平均值為-0.455,pI值為5.43,屬于酸性蛋白。該蛋白負電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為60個,帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為54個。其氨基酸序列的不穩(wěn)定系數(shù)為39.85,判定該蛋白具有穩(wěn)定性。(3)β-葡萄糖苷酶的一級結構分析通過在線分析工具,預測分析β-葡萄糖苷酶的親/疏水性并預測分析其跨膜結構域,得到該蛋白親水性較強;預測分析其信號肽信息以及預測分析其磷酸化位點,得到S值小于分泌型蛋白閾值0.5;該蛋白質含有39個磷酸化位點;該酶位于細胞膜。因此,初步推測該酶位于細胞膜,屬于可溶性非分泌型蛋白,親水性較強且無信號肽、可能存在跨膜結構域,具有多個磷酸化位點。(4)β-葡萄糖苷酶的同源序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建與分析將嗜酸乳桿菌β-葡萄糖苷酶的編碼氨基酸序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中,利用BLAST進行同源序列比對分析。結果表明:嗜酸乳桿菌β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中被認為對底物識別和結合重要的氨基酸殘基保守區(qū)域位于第210~214位,分別為Tyr(Y)、Gln(Q)、Ser(S)、Gly(G)、His(H)。通過構建β-葡萄糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)育樹,并對其進行同源性比對分析。結果表明:嗜酸乳桿菌β-葡萄糖苷酶與來自嗜酸乳桿菌ATCC 4796的水解酶HMPREF0492(登錄號EEJ75268.1)同源性最高,且與該序列具有最高的親緣性;其次是乳酸菌DSM 20249(登錄號KRK76876.1)與其氨基酸序列一致性為100%;與多粘類芽孢桿菌(登錄號SUA71531.1)和多粘類芽孢桿菌SQR-21(登錄號AHM67667.1)的親緣關系最遠。(5)β-葡萄糖苷酶的二級結構分析利用PSIPRED和WOLF SOPMA在線分析軟件,對蛋白的二級結構進行預測。結果表明:PSIPRED預測蛋白二級結構中24.88%α-螺旋,15.26%β-折疊,無規(guī)則卷曲元件貫穿于整個氨基酸序列中。WOLF SOPMA預測蛋白二級結構主要由46.95%無規(guī)則卷曲元件、29.58%α-螺旋、17.37%β-折疊、6.10%β-轉角構成。因此可知,該蛋白的二級結構主要由α-螺旋結構、β-折疊結構、無規(guī)則卷曲元件組成。3、β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達、純化及圓二色譜分析采用PCR體外擴增技術獲得β-葡萄糖苷酶的目的基因,將目的基因片段同載體PET-28a(+)進行雙酶切、連接、轉化、陽性克隆篩選,得到的重組載體PET-28a(+)-bgl導入感受態(tài)大腸桿菌中誘導表達。采用超聲破碎菌體,經鎳親和層析柱層析、透析袋過夜透析、PEG 20000濃縮、微濾膜濃縮,再利用SDS-PAGE法、蛋白印跡法驗證蛋白純度。將純化后的目標蛋白采用圓二色譜法,測定其二級結構。結果表明:重組β-葡萄糖苷酶被成功表達且純度達到電泳純,β-葡萄糖苷酶濃度為1.88 mg/mL。在190-260 nm遠紫外區(qū),β-葡萄糖苷酶的二級結構中α-螺旋結構占15.9%,β-折疊占44.1%,β-轉角占18.1%,無規(guī)則卷曲元件占27.2%。4、β-葡萄糖苷酶酶學性質研究(1)β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度及其熱穩(wěn)定性探究野生型酶與重組酶在20℃~90℃的最適反應溫度,并將其在不同溫度下孵育處理,研究野生型酶與重組酶的熱穩(wěn)定性。結果表明:野生型酶與重組酶最適反應溫度均為47℃。野生型酶和重組酶在20℃~50℃時均具有較好的熱穩(wěn)定性。該酶具有較好的耐熱性、熱穩(wěn)定性。(2)β-葡萄糖苷酶的最適反應pH及其pH穩(wěn)定性探究野生型酶與重組酶在催化反應體系pH 2.2~8.0的最適反應pH,并將其在不同pH條件下靜置4 h后,研究野生型酶與重組酶的pH穩(wěn)定性。結果表明:野生型酶與重組酶的最適反應pH差異較小,野生型酶最適反應pH值為5.0,重組酶最適反應pH值為5.6。野生型酶和重組酶均在pH 2.2~6.0時,具有一定的pH穩(wěn)定性。該酶不僅具有廣泛的pH穩(wěn)定性,而且具有一定的耐酸性。(3)有機溶劑對β-葡萄糖苷酶的影響探究無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮4種有機溶劑對野生型酶、重組酶酶活的影響。結果表明:甲醇、乙酸乙酯、丙酮對β-葡萄糖苷酶的抑制作用較強;無水乙醇對野生型酶、重組酶的抑制作用相對較弱。(4)金屬離子對β-葡萄糖苷酶的影響探究Na~+、Ka~+、Li~+等金屬離子對野生型酶與重組酶的影響。結果表明:Na~+、Ka~+、Li~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Al~(3+)對野生型酶及重組酶均有不同程度的抑制作用。Ka~+、Li~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)對β-葡萄糖苷酶的抑制作用相對較小,Hg~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Ba~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)對野生酶及重組酶的激活作用較為顯著。Fe~(3+)、Fe~(2+)對野生型酶及重組酶的促進作用更為突出,Na~+、Al~(3+)對野生型酶及重組酶的抑制作用較強。(5)β-葡萄糖苷酶對葡萄糖、NaCl的耐受性研究探究不同濃度葡萄糖及NaCl,對野生型酶及重組酶的影響。結果表明:1.5 mol/L葡萄糖促使野生型酶和重組酶的酶活達到最大值,相對酶活分別增加84.30%、39.01%。重組酶較野生型酶的耐糖性更好,適用于后續(xù)應用開發(fā)。2.0 mol/L NaCl對野生型酶、重組酶的酶活具有一定的激活作用,分別使其酶活提高79.11%、51.40%。NaCl對重組酶的耐受性較野生型酶強。(6)β-葡萄糖苷酶動力學參數(shù)分別以p-NPG、蘆丁、異槲皮素為底物與重組酶和野生型酶相互作用,探究不同底物與β-葡萄糖苷酶的動力學參數(shù)米氏常數(shù)K_m及最大反應速率V_(max)。結果表明:重組酶和野生型酶與p-NPG反應時,K_m值分別為0.204 mmol/L、0.684 mmol/L,V_(max)值為0.133mmol/L.min、0.662 mmol/L.min。當野生型酶與Rut、Iso催化反應時,K_m值為1.000 mmol/L、0.601 mmol/L,V_(max)值為1.340 mmol/L.min、1.157 mmol/L.min;當重組酶與Rut和Iso催化反應時,K_m值為0.357 mmol/L、0.326 mmol/L,V_(max)值為0.822 mmol/L.min、1.030 mmol/L.min。因此,可知重組酶與p-NPG間的親和能力較野生型酶強,K_(m(Rut))K_(m(Iso))表明Rut與β-葡萄糖苷酶相互作用時親和能力更好。5、β-葡萄糖苷酶與槲皮素糖苷底物相互作用的熒光光譜分析采用熒光光譜、紫外吸收光譜、同步熒光光譜法,探究Rut和Iso與β-葡萄糖苷酶的結合方式,Rut和Iso對β-葡萄糖苷酶的淬滅作用機制,以及二者對該蛋白酶構象變化的影響等。結果表明:(1)β-葡萄糖苷酶與Rut及Iso的結合距離r分別為4.52×10~-33 nm、3.65×10~-33 nm,均小于7 nm且r_((Rut))r_((Iso))�？赏茢郣ut及Iso同β-葡萄糖苷酶間存在非輻射能量轉移,且Iso與β-葡萄糖苷酶相互作用時結合距離較Rut更近,更利于Iso同β-葡萄糖苷酶的相互結合作用。由于β-葡萄糖苷酶與槲皮素糖苷底物間的非輻射能量轉移,促使β-葡萄糖苷酶的內源性熒光強度被降低,產生熒光淬滅現(xiàn)象。(2)Rut和Iso對β-葡萄糖苷酶的熒光淬滅作用符合靜態(tài)淬滅機制,Rut的淬滅常數(shù)K_(SV)為6.13×10~5 L/mol,速率常數(shù)K_q為6.13×10~133 L/mol;Iso的K_(SV)為3.13×10~5 L/mol,K_q為3.13×10~133 L/mol。Rut對β-葡萄糖苷酶的淬滅常數(shù)大于Iso,說明Iso對β-葡萄糖苷酶的熒光淬滅作用較Rut強,且對β-葡萄糖苷酶的構象存在不同程度的影響。(3)當Δλ=15 nm時,Rut-β-葡萄糖苷酶體系的最大發(fā)射波長藍移(284→279 nm);Iso促使β-葡萄糖苷酶體系的最大發(fā)射波長藍移(278→277 nm),表明Tyr殘基所處微環(huán)境的疏水性增強。當Δλ=60 nm時,Rut與Iso對β-葡萄糖苷酶Trp殘基所處微環(huán)境的影響不明顯。同時,在相同熒光淬滅條件下,Iso對Trp殘基的同步熒光淬滅作用較Rut強,但Rut對β-葡萄糖苷酶的Tyr殘基微環(huán)境的疏水性影響較大。(4)Rut和Iso同β-葡萄糖苷酶相互作用時Rut和Iso與β-葡萄糖苷酶結合常數(shù)Ka分別為0.50×10~7 L/mol、0.31×10~7 L/mol,表明Rut同β-葡萄糖苷酶的結合作用較Iso強。
【學位單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：
1999 年）。蘆丁又名槲皮素-3-O糖組成；異槲皮素又名槲皮素-3-O-葡素、蘆丁、異槲皮素化學結構式見圖化合物，但極少數(shù)以游離態(tài)（槲皮素苷）的形式廣泛存在（孫慧慧，20153-O-蕓香糖苷（蘆�。�，3-O-鼠李糖糖苷（螺旋花苷）（Middleton，1998 中生物利用度較低（Fujimori 等人，更高的生物利用率（劉萍等人，2006 皮素糖苷（Nile 等人，2017 年），也與在攝取后幾乎不被吸收。黃酮是刺梨其主要構成成分，因此槲皮素糖苷的
大多數(shù)以結合態(tài)（槲皮素糖苷）的形式廣泛存在（孫慧慧，2015 年）。其中最常見的是 3-O-葡萄糖苷（isoquercetin），3-O-蕓香糖苷（蘆�。�，3-O-鼠李糖苷（槲皮苷）和 3-O-半乳糖苷（金絲桃苷），4'-O-葡糖苷（螺旋花苷）（Middleton，1998 年）。槲皮素易于溶解，但溶解速率低，導致在胃腸道中生物利用度較低（Fujimori 等人，2015 年）。相關研究證明，黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率（劉萍等人，2006 年），槲皮素在體內的生物利用率及抗氧化活性優(yōu)于槲皮素糖苷（Nile 等人，2017 年），也與糖苷存在的位置有關（Lee等人，2016 年），且糖苷在攝取后幾乎不被吸收。黃酮是刺梨中重要功能成分，其中游離態(tài)槲皮素和鍵合態(tài)槲皮素是其主要構成成分，因此槲皮素糖苷的高效水解轉化對提高刺梨功能具有重要意義。圖 1-1 黃酮類化合物的化學結構式Fig.1-1 Molecular structures of Flavonoids.
圖 1-3 Rut 酶解為 Iso 和 Que 的轉化途徑Fig.1-3 Hydrolytic pathway from Rut to Que and Iso1.2.3 黃酮苷元的β-葡萄糖苷酶酶解轉化因此，如何通過去糖基定向修飾黃酮類化合物分子結構，高效釋放苷元，是提高黃酮特定功能及其生物利用率的重要途徑。目前，制備黃酮苷元多采用化學法，如醚化、酯化、�；然瘜W衍生化反應水解黃酮糖苷生產黃酮苷元。但是這些反應過程往往屏蔽了黃酮化合物的主要官能團——酚羥基，不利于產物的抗氧化作用（高金明等人，1998 年；王秋安，1999 年），同時化學法產物較為復雜，黃酮類化合物水解產物的安全性有待于進一步研究。
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本文編號：
2883507
