體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)又稱為克隆,是目前動(dòng)物細(xì)胞工程領(lǐng)域一種研究細(xì)胞重編程常用的技術(shù)手段,可以將終末分化的細(xì)胞重新編程為具有全能性狀態(tài)的細(xì)胞,并發(fā)育為同質(zhì)個(gè)體后代。盡管核移植技術(shù)在重編程研究中具有安全和可獲得全能性細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn),但是在多數(shù)動(dòng)物中重編程的效率仍然非常低,大部分克隆胚胎在早期發(fā)育期間會(huì)發(fā)生發(fā)育阻滯。研究表明克服表觀遺傳障礙是目前提高重編程效率的重要策略,其中關(guān)鍵組蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3已經(jīng)被明確標(biāo)記為重編程表觀屏障,而關(guān)于DNA甲基化分子標(biāo)記物的報(bào)導(dǎo)卻很少,急需通過(guò)組學(xué)方法進(jìn)行挖掘分析。本文的研究中,我們分析了不同發(fā)育命運(yùn)克隆胚胎與正常受精胚胎的DNA甲基化譜,發(fā)現(xiàn)克隆胚胎與正常受精胚胎相比在全局去甲基化的過(guò)程中表現(xiàn)出甲基化較高的特點(diǎn),我們進(jìn)一步對(duì)差異甲基化區(qū)域(Differentially Methylated Regions,DMRs)進(jìn)行分析并識(shí)別出克隆胚胎中三種異常的甲基化模式,包括重新甲基化的DMRs(rDMRs)、持續(xù)甲基化的DMRs(pDMRs)和去甲基化的DMRs(dDMRs)。另外,我們發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域、第一內(nèi)含子和3'UTR是DMRs重點(diǎn)分布的基因組功能區(qū)域,并且DMRs的長(zhǎng)度與DNA甲基化水平的差異明顯的負(fù)相關(guān),DMRs長(zhǎng)度越短,DNA甲基化水平變化越大。克隆胚胎較高的甲基化水平導(dǎo)致早期合子基因組基因、多能性維持因子以及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子未正確激活,這是克隆胚胎重編程失敗的重要原因。之后,我們聯(lián)合轉(zhuǎn)錄RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,鑒定出SCNT中高DNA甲基化與基因表達(dá)下調(diào)的基因簇,這些基因的低表達(dá)會(huì)引起克隆胚胎發(fā)育脫離正常軌道。進(jìn)一步我們通過(guò)構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別出一系列關(guān)鍵重編程表觀障礙因子,包括Sp110、Sp140、Pcgf5、Zfp207、Ubtfl1、Serbp1、Dppa2、Yy1、Prps1、Rrn3、Obox6、Kpna2、Elovl6、Trim13、Katna1等。其中Dppa2、Obox6、Pcgf5、Yy1、Rrn3等已被證實(shí)是體細(xì)胞重編程中關(guān)鍵基因,對(duì)促進(jìn)細(xì)胞重編程的進(jìn)程有重要作用。最后,我們對(duì)細(xì)胞重編程中甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt家族)和去甲基化酶(Tet家族)進(jìn)行了系統(tǒng)的比較分析,研究發(fā)現(xiàn)Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在克隆胚胎中基因表達(dá)水平升高,而Tet家族中,只有Tet1基因表達(dá)水平下降,這表明克隆胚胎的高甲基化可能是由Dnmt家族的高表達(dá)和Tet1的低表達(dá)共同造成的。本研究全面地分析了克隆胚胎全基因組DNA甲基化的異常模式,為克服重編程中DNA甲基化表觀遺傳屏障,提高重編程效率提供了一定的理論支持,對(duì)于后期體細(xì)胞核移植的臨床應(yīng)用具有一定的幫助。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q813
【部分圖文】：

細(xì)胞編程與重編程.1 細(xì)胞編程細(xì)胞編程的過(guò)程實(shí)際上是細(xì)胞不斷分化并喪失全能性的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物中，細(xì)胞的編于受精卵細(xì)胞。由于受精的過(guò)程，卵母細(xì)胞染色體數(shù)目加倍，重新激活了處于靜止期（M2細(xì)胞。經(jīng)過(guò)多次快速的有絲分裂形成了大量的卵裂球，而由于卵裂速度快，并處于保護(hù)質(zhì)殼（透明帶）中，來(lái)不及伴隨細(xì)胞體積和物質(zhì)增加，因此核質(zhì)指數(shù)不斷升高，卵裂速慢或停滯，直到從透明帶中孵出才能繼續(xù)發(fā)育。隨著卵裂球的致密化，形成實(shí)心細(xì)胞團(tuán)為桑椹胚（morula），以模型動(dòng)物小鼠為例，大約發(fā)育到 3.5 天左右，桑椹胚形成空心結(jié)分化為兩個(gè)細(xì)胞群體：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner Cell Mass, ICM）和滋養(yǎng)層（Trophectoderm, TE）為囊胚。其中滋養(yǎng)層是胚胎胎盤成分的前體，而包裹充滿液體的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，包含原始內(nèi)，和更深層的多能外胚層細(xì)胞，它們是胎兒發(fā)育的祖細(xì)胞來(lái)源（圖 1-1）。

圖 1-2 不同重編程技術(shù)示意圖[8]Fig 1-2 Schematic diagram of different reprogramming techniques[8]傳學(xué)的研究技術(shù)與方法學(xué)是對(duì)可遺傳表型變化的研究，這種變化是由改變基礎(chǔ) DNA 序是在染色質(zhì)修飾的背景下進(jìn)行。表觀遺傳修飾作用在染色質(zhì)的高控，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。表觀遺傳學(xué)這一名詞最初是由 W基因的物理性質(zhì)及其在遺傳中的作用尚不清楚，因此很難解釋表觀遺傳學(xué)是經(jīng)典遺傳學(xué)的另一方面，提供基因時(shí)空特異性表達(dá)的指白共價(jià)修飾、染色質(zhì)可及性的調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)基因選擇性轉(zhuǎn)錄；要是由基因組中的非編碼 RNA 實(shí)現(xiàn)的。這些所有的表觀遺傳修飾

圖 2-1 數(shù)據(jù)分析流程Fig. 2-1 Data analysis process.2 數(shù)據(jù)的下游分析.2.1 差異甲基化位點(diǎn)與差異表達(dá)基因分析首先進(jìn)行差異 DNA 甲基化分析，剔除覆蓋度小于 3 的 CpG 位點(diǎn)，剩余位點(diǎn)作為有pG 位點(diǎn)用于之后的分析。定義| β|>0.2，wilcoxon 秩和檢驗(yàn) p-value <0.05 的 CpG 位點(diǎn) DNA 甲基化位點(diǎn)，其中 p-value 越小認(rèn)為差異顯著性越高。對(duì)于差異基因分析，首先剔除了樣品中所有重復(fù)樣本 FPKM< 0.1 的基因，剩余的基是表達(dá)的基因。差異表達(dá)分析使用 R 包 DEseq2 進(jìn)行，定義差異倍數(shù)大于 2 倍差異og2FC > 1 為上調(diào)，log2FC < -1 為下調(diào)，并且 q-value< 0.05 為差異表達(dá)基因。q-value -value 矯正的結(jié)果。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 曹鵬波;小鼠克隆胚胎重編程的DNA甲基化模式分析與表觀標(biāo)記挖掘[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

2 楊勝楠;泛癌癥DNA甲基化模式分析[D];西安電子科技大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2844032