生育期(特別是開花期)是影響大豆品種分布和產(chǎn)量的重要因素之一,大豆生育期調(diào)控基因的挖掘和研究,對(duì)選育生態(tài)適應(yīng)性廣的優(yōu)良大豆品種至關(guān)重要。迄今,諸多調(diào)控大豆生育期的E系列基因已被克隆,它們的應(yīng)用提高了育種效率和產(chǎn)量,但仍未完全解決育種問題。因此,本試驗(yàn)旨在圖位克隆新的生育期基因,并進(jìn)行功能分析,進(jìn)一步為大豆適應(yīng)性和產(chǎn)量的提高提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:1.利用Minsoy(Ele2e3E4)和Archer(elase2E3E4)雜交后構(gòu)建的MA重組自交系進(jìn)行長日照條件下開花期QTL檢測(cè)。通過親本重測(cè)序和MA群體SLAF-seq,共開發(fā)了 5,074個(gè)分子標(biāo)記,構(gòu)建出總長度為3,588.94cM的高密度遺傳圖譜。結(jié)合F6代和F8代MA群體的花期表型,檢測(cè)到三個(gè)穩(wěn)定遺傳的花期QTL(TOF5、TOF6.和和TOF7),分別位于5號(hào)、6號(hào)和7號(hào)染色體上。其中TOF61與E1基因所在基因組位點(diǎn)重合,且E1在本群體中有分離,故TOF6.1可能是E1基因。TOF7對(duì)花期貢獻(xiàn)率僅次于TOF6.1,其編碼基因未見報(bào)道。所以,TOF7是一個(gè)新花期位點(diǎn)。2.利用MA群體的7號(hào)染色體遺傳圖譜和兩年的花期數(shù)據(jù),將TOF7粗定位在Chr7:3904858和Chr7:4936114之間,約1.03Mb內(nèi),并篩選到該區(qū)間的剩余片段雜合系(Residual heterozygous lines,RHLs),#13 和#131。通過對(duì) RHLs#13和#131的花期和生育期鑒定,這2個(gè)家系F2后代均呈現(xiàn)出3:1的分離比例,且F3后代均符合1:2:1的分離比,表明TOF7位點(diǎn)由單基因控制。利用TOF7位點(diǎn)的近等基因系(Near-isogenic lines,NILs),NIL-TOF7 植株比 NIL-tof7 的花期和生育期明顯提前,說明TOF7基因控制早花早熟。進(jìn)一步精細(xì)定位,TOF7位點(diǎn)縮小到約138kb區(qū)間內(nèi),并鑒定到TOF7的候選基因?yàn)橐粋�(gè)擬南芥光周期調(diào)控開花途徑中關(guān)鍵生物鐘基因的同源基因。3.通過基因序列分析,TOF7基因CDS區(qū)在親本間存在非同義堿基差異,且該堿基變異使編碼蛋白N端核定信號(hào)區(qū)的第9位氨基酸發(fā)生置換。進(jìn)而對(duì)目的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位,親本Minsoy中TOF7蛋白主要定位于細(xì)胞核中;而親本Archer中tof7蛋白則定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。擬南芥功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示,親本Minsoy中的TOF7可回補(bǔ)擬南芥同源基因突變體的早花早熟表型,而親本Archer中的候選基因則不能。利用CRISPR-cas9基因編輯技術(shù),將TOF7基因堿基缺失突變后,與野生型植株(Wild-Type,WT)相比,長日照條件下突變體明顯推遲開花5-6天,生育期延長約15天。這些結(jié)果充分證明了 TOF7基因的非同義突變導(dǎo)致蛋白亞細(xì)胞定位變化而形成晚花和晚熟。此外,NIL-tof7和突變株tof7分別比NIL-TOF7和WT的單株產(chǎn)量高,這說明TOF7對(duì)育種的重要性。4.TOF7基因呈現(xiàn)24h生物鐘節(jié)律表達(dá),且主要在大豆三重復(fù)葉中表達(dá)。在大豆光周期調(diào)控花期的信號(hào)途徑中,TOF7基因通過抑制El基因的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)GmFT2a和GmFT5a基因的表達(dá),致使開花提前。這些結(jié)果將補(bǔ)充大豆生物鐘基因調(diào)控開花方面的研究。綜上所述,本研究是以QTL定位為基礎(chǔ),圖位克隆到一個(gè)新的、主要的花期調(diào)控基因TOF7。通過亞細(xì)胞定位、功能互補(bǔ)及突變體等多種方法,證明了TOF7控制早花早熟,并參與到大豆E1-E4構(gòu)成的生育期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。本研究將促進(jìn)大豆光周期調(diào)控生育期途徑的深入認(rèn)知,為大豆品種的適應(yīng)性和分子育種提供有力的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1;Q943.2
【部分圖文】：

邐大豆生育期基因ｒ0ｆ７的圖位克隆與功能分析邐逡逑有Ｇ／（Ｇ／Ｇ＾ＭＥＬ４）基因等，詳細(xì)敘述見下。生物節(jié)律的控制基于一種轉(zhuǎn)錄和翻譯逡逑的負(fù)反饋機(jī)制，一些蛋白可以拮抗轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而下調(diào)自身的表達(dá)（Ｈａｒｍｅｒ逡逑ａｎｄ邋Ｋａｙ，邋２００５）邋0逡逑ｍｏｒｎｉｎｇ邐？ｗａｎｉｎｇ逡逑￣￣￣

１．２．３．３大豆花期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步研究逡逑隨著大豆生育期關(guān)鍵基因的克隆及功能的逐步驗(yàn)證，大豆光周期調(diào)控生育期逡逑的分子機(jī)制也得到進(jìn)一步的明確，見圖１．２。逡逑Ｅ３邋Ｅ４逡逑ｂｉ邐邐（ｔｎ￣邋￡１逡逑！邐Ｊ逡逑NN逡逑個(gè)邋ＦＴ２＿邋卜邋＜邋ＦＴ５ａ邐ＦＴ２ａ邋少，ＦＴ５ａ，邋｜逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑Ｅａｒｌｙ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ邐Ｌａｔｅ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ逡逑Ｌｏｗ邋ｇｒａｉｎ邋ｙｉｅｌｄ邐Ｈｉｇｈ邋ｇｒａｉｎ邋ｙｉｅｌｄ逡逑ｌ邐ｌ逡逑圖１．２大豆開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｎｅｔｗｏｒｋ邋ｆｏｒ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ邋ｉｎ邋ｓｏｙｂｅａｎ逡逑大豆生育期基因五３和五４基因分別編碼光敏色素基因Ｐ／／Ｚ４３和尸／／Ｚ４２，是逡逑控制大豆光周期開花和光周期敏感性的主要基因。五３和五４基因調(diào)控大豆開花是逡逑通過誘導(dǎo)五７表達(dá)，進(jìn)而抑制Ｆｒ（ＧｍＦ７２ａ和ＧｍＦｒｋ）的轉(zhuǎn)錄，從而抑制開花逡逑（Ｋｏｎｇ等，２０１０）。在短日照條件下，？／基因表達(dá)受到光敏色素蛋白Ｅ３和Ｅ４的誘逡逑導(dǎo)調(diào)控，？／基因受到五３說的抑制表達(dá)。Ｊ蛋白能夠與五／基因啟動(dòng)子的ＬＵＸ元逡逑１０逡逑

行３＇端加Ａ處理、連接Ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘ測(cè)序接頭、ＰＣＲ擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選逡逑取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行ＰＥ１２５ｂｐ測(cè)序。逡逑具體實(shí)驗(yàn)流程如圖２．１所示：逡逑Ｇｅｎｏｍｅ邐ｓｉｚｅ邐ｓ逡逑？邐ｓｄｅｄｉｏｎ邋三—三{逡逑具邐Ｉ—邋ｃｍ逡逑%煎危劍義希模椋紓澹螅簦椋錚鑠義希劍健義希粒簦幔椋歟椋睿玨鍚姡哄危海海駑義希眨梗幔�，ｅP睢�？燃偓ｌ}0咖＾逡逑？邐＝＾丨４叫ｓ逡逑＞Ｃｌ２Ｚ逡逑圖２．１邋ＳＬＡＦ實(shí)驗(yàn)流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｐｒｏｔｏｃａｌ邋ｏｆ邋ＳＬＡＦ逡逑２．１．４．３分子標(biāo)記的開發(fā)逡逑ＳＬＡＦ－ｓｅｑ文庫的測(cè)序原始測(cè)序讀長為ＰＥ１２５ｂｐ。為保證信息分析質(zhì)量，在逡逑分析前會(huì)對(duì)原始測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，原始數(shù)據(jù)過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：逡逑（１）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 蓋鈞鎰,汪越勝;中國大豆品種生態(tài)區(qū)域劃分的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2001年02期

2 任全興,蓋鈞鎰,馬育華;我國大豆品種生育期生態(tài)特性研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);1987年05期

本文編號(hào)：2831329