基因組不斷受到來自內(nèi)外環(huán)境的壓力(如紫外線和電離輻射等)造成DNA損傷。細胞內(nèi)DNA損傷觸發(fā)細胞周期檢查點激活,導致細胞周期進程延遲或阻滯,阻止細胞復制并且誘導細胞進行DNA損傷修復。Clamp 9-1-1復合體和clamp loader Rad24-RFC在細胞周期檢查點激活方面起著重要作用。9-1-1復合體是由Rad9-Hus1-Rad1組成的環(huán)形異源三聚體復合物,其中Rad9/Ddc1的C端含有大量磷酸化的位點和蛋白相互作用位點,包括DNA損傷修復關鍵激酶ATR和TopBP1等。但是由于Rad9/Ddc1 C端結構柔性程度高,目前還沒有9-1-1復合體的完整結構。解析9-1-1復合體在不同狀態(tài)下的(包括DNA損傷條件下)完整結構,尤其是獲得Rad9/Ddc1的結構變化能夠更好地幫助我們理解9-1-1復合體如何參與DNA損傷響應。Rad24-RFC是一個異源五聚體,由最大的亞基Rad24和四個小亞基RFC2-5組成。在DNA損傷修復過程中,Rad24-RFC負責協(xié)助9-1-1復合體加載到DNA損傷位點,起到穩(wěn)定DNA構象和激活DNA損傷檢查點的作用。基于9-1-1復合體與增殖細胞核抗原(PCNA)在結構上的相似性,目前認為9-1-1復合體與Rad24-RFC間相互作用可能與PCNA與RFC間相互作用相似,但是目前并沒有直接的證據(jù)表明9-1-1復合體與Rad24-RFC行使相似的機制。因此,獲得9-1-1復合體與Rad24-RFC復合物的完整結構及其動態(tài)相互作用的結構信息將會極大地幫助我們理解clamp加載過程,但是目前還沒有二者相互作用的結構信息,甚至連Rad24-RFC的結構信息也很少。本課題我們利用冷凍電鏡技術解析了釀酒酵母中9-1-1復合體的完整結構,首次解析了Ddc1亞基的全長結構并發(fā)現(xiàn)Ddc1結構柔性受到精細調(diào)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下,9-1-1復合體具有多種構象,Ddc1 C-tail是高度動態(tài)的。我們獲得了三種相對穩(wěn)定的構象,包括Ddc1 C-tail位于環(huán)狀區(qū)域的阻擋DNA結合的構象,Ddc1 C-tail遠離環(huán)狀區(qū)域的閉合構象以及環(huán)打開的開口構象。甲基磺酸甲酯(MMS)是一種DNA損傷誘導劑,能夠造成細胞基因組發(fā)生斷裂,為了深入研究,我們也獲得了MMS誘導條件下的9-1-1復合體。在生化上,MMS誘導的9-1-1復合體的Ddc1亞基在電泳上遷移出多條條帶,質(zhì)譜結果顯示均為Ddc1,考慮到Ddc1 C-tail包含眾多磷酸化位點,這暗示在DNA損傷條件下Ddc1發(fā)生了不同程度的磷酸化。同時我們也解析了MMS誘導的9-1-1復合體的完整結構,與正常生理狀態(tài)下的9-1-1復合體結構相比,MMS誘導的9-1-1復合體構象變得均一,Ddc1 C-tail主要位于環(huán)狀區(qū)域外�；谏徒Y構分析,Ddc1 C-tail的結構柔性很大可能與DNA損傷響應相關。Rad53作為DNA損傷響應的效應激酶,是DNA檢查點激活的重要指示劑,我們的磷酸化實驗發(fā)現(xiàn),Ddc1 C-tail敲除將會導致G1/G2期Rad53的磷酸化完全喪失或降低,這一數(shù)據(jù)說明Ddcl C-tail在DNA損傷響應中發(fā)揮著重要作用。為了解析Rad24-RFC的結構,我們嘗試了內(nèi)源性表達和重組表達。在內(nèi)源性純化Rad24-RFC時,我們發(fā)現(xiàn)能夠共純化出Mec1/Ddc2(ATR/ATRIP),二維結構分析也發(fā)現(xiàn)存在二者復合體。在之前的研究中Rad24-RFC一直被認為作為clamp loader協(xié)助9-1-1復合體加載到DNA損傷位點,一旦完成,Rad24-RFC將會從DNA損傷處解離。我們的共純化結果或許暗示了Rad24-RFC在體內(nèi)能夠與Mec1/Ddc2發(fā)生直接的相互作用。由于內(nèi)源性純化的Rad24-RFC濃度和均一度比較低,因此我們嘗試重組表達獲得Rad24-RFC樣品。在高鹽、高去垢劑的純化條件下,我們獲得了高濃度和高純度的Rad24-RFC,同時我們也首次解析了Rad24-RFC的完整結構。在負染結構中,Rad24-RFC部分構象呈現(xiàn)出“U”型結構,中間含有一條深溝;部分構象呈現(xiàn)出“爪”型。參與DNA復制的clamp loader RFC復合體(RFC1-5)與Rad24-RFC共享了四個相同的小亞基RFC2-5,基于RFC復合體的晶體結構,我們確定了Rad24模塊結構。同時我們將RFC1與Rad24的density進行單獨比較,二者結構十分相似。結合PCNA與9-1-1復合體的結構相似性,Rad24-RFC與RFC復合體的結構相似或許暗示著這兩對clamp-clamp loader的相互作用機制存在一定的相似�；谝陨辖Y構信息,我們也對9-1-1復合體與Rad24-RFC間相互作用進行了研究,我們發(fā)現(xiàn),二者相互作用在體內(nèi)受到DNA損傷應激調(diào)控。在體外我們也成功組裝了Rad24-RFC/9-1-1超級復合物,這也為我們后續(xù)解析三維結構奠定了基礎。
【學位單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q75
【部分圖文】：

其中ＡＴＲ負責啟動ＤＮＡ單鏈損傷修復，ＡＴＭ負責啟動ＤＮＡ雙鏈損傷修復，逡逑二者在細胞周期阻滯、細胞凋亡、ＤＮＡ損傷修復和染色質(zhì)重塑等方面發(fā)揮重要逡逑作用［５］（圖１．１）。逡逑１逡逑

９－１－１復合體作為ｃｌａｍｐ在ｃｌａｍｐ邋ｌｏａｄｅｒ邋Ｒａｄ２４－ＲＦＣ的協(xié)助下結合到ＤＮＡ逡逑單雙鏈損傷處，同時招募和激活Ｍｅｃｌ／Ｄｄｃ２，激活的Ｍｅｃｌ／Ｄｄｃ２磷酸化下游效逡逑應激酶Ｒａｄ５３將損傷信號傳遞下去從而完成ＤＮＡ損傷修復過程［１０］（圖１．２）。逡逑ＤＮＡ損傷檢查點激活是一個由多個蛋白參與的多步反應過程，但是目前對于該逡逑過程激活機制還不是很清楚。逡逑本文我們主要以ｃｌａｍｐ邋９－１－１復合體和ｃｌａｍｐ邋ｌｏａｄｅｒ邋Ｒａｄ２４－ＲＦＣ為研宄對象逡逑解析二者結構，同時對９－１－１復合體與Ｒａｄ２４－ＲＦＣ間相互作用進行研宄。希望對逡逑于９－１－１復合體如何在Ｒａｄ２４－ＲＦＣ協(xié)助下加載到ＤＮＡ損傷處這一生物學過程有逡逑更深入的理解。逡逑／ｋ逡逑．一邐逡逑ｎｅｒ邐一一’邐逡逑令邐Ｃ＾ｄｃ２邐（Ｒｇ９）逡逑—＞？邋ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋Ｍｅｃｌ邐ｃｅｉｌ邋ｃｙｃｌｅ逡逑—？邋Ｄｄｃ１－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋Ｍｅｃｌ邐ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逡逑—？邋Ｒａｄ５３邋ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邐ｒｅｐａｉｒ逡逑圖１．２釀酒酵母中ＤＮＡ損傷檢g慵せ钅Ｐ停郟

本文編號：2816296