【摘要】：雌激素相關(guān)受體(ERR)作為轉(zhuǎn)錄因子家族的一員,參與調(diào)控許多重要的生命進(jìn)程。在哺乳動(dòng)物中,ERR與能量代謝和癌癥相關(guān),它也被作為乳腺癌和宮頸癌等相關(guān)癌癥的檢測(cè)靶標(biāo)。在果蠅中,ERR可以作為能量代謝的開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)節(jié)果蠅的發(fā)育過(guò)程。在家蠶中,目前已鑒定和克隆到了家蠶ERR基因(BmERR),并報(bào)道了BmERR可以參與調(diào)控卵黃原蛋白基因的表達(dá)。那么在家蠶中,BmERR除了參與調(diào)控卵黃原蛋白基因的表達(dá),是否還存在其它的功能呢?本研究以家蠶胚胎發(fā)育過(guò)程這個(gè)能量代謝旺盛時(shí)期為切入點(diǎn),對(duì)BmERR在家蠶胚胎發(fā)育時(shí)期的功能進(jìn)行了研究,結(jié)果如下:(1)家蠶胚胎發(fā)育過(guò)程中BmERR和糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析本研究首先通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)了BmERR在家蠶胚胎時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)特征,證實(shí)了BmERR在家蠶胚胎時(shí)期是有蛋白表達(dá)的,暗示著其可能存在著一定的生物學(xué)功能。為了研究BmERR對(duì)能量代謝的影響,本研究同時(shí)檢測(cè)了糖酵解過(guò)程中磷酸果糖激酶(BmPFK)、己糖激酶(BmHK)和丙酮酸激酶(BmPK)三個(gè)限速酶基因的表達(dá)譜。分析發(fā)現(xiàn),BmERR與上述三個(gè)糖酵解限速酶的表達(dá)趨勢(shì)很相似,預(yù)示著它們之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性。(2)BmERR對(duì)糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響為了驗(yàn)證BmERR與BmPFK、BmHK和BmPK三個(gè)限速酶基因的關(guān)系,本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)、干涉、抑制劑處理三種方式來(lái)改變BmERR的表達(dá)量,并分析下游糖酵解限速酶是否發(fā)生變化。首先,在BmE細(xì)胞上過(guò)表達(dá)BmERR以后,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)糖酵解中的三個(gè)限速酶基因都顯著上調(diào);然后,通過(guò)干涉BmERR和抑制劑處理細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)三個(gè)限速酶基因顯著下調(diào)。表明BmERR的表達(dá)量的變化會(huì)直接影響到BmHK、BmPK和BmPFK基因的表達(dá)變化。除了在細(xì)胞上干涉BmERR外,我們?cè)谛Q卵個(gè)體上也做了初步的干涉實(shí)驗(yàn)。將干涉雙鏈dsBmERR和對(duì)照dsEGFP以濃度為1000 ng/μL的劑量分別注射到剛產(chǎn)下的蠶卵中,到蠶卵中的雙鏈最終濃度大約為3 ng/粒。當(dāng)對(duì)照組在產(chǎn)卵后第13天時(shí),孵化率達(dá)到67.5%;而實(shí)驗(yàn)組需要在產(chǎn)卵后第14天才達(dá)到64.1%左右。表明在家蠶胚胎發(fā)育時(shí)期干涉BmERR可以延遲家蠶胚胎發(fā)育一天的時(shí)間,但不會(huì)出現(xiàn)致死。在家蠶產(chǎn)卵后第4天時(shí),對(duì)其葡萄糖的含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,注射了dsBmERR的蠶卵葡萄糖的含量有顯著性升高相比與對(duì)照組。同時(shí),當(dāng)胚胎發(fā)育到點(diǎn)青時(shí)提取總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA用于定量分析,qRT-PCR分析顯示,dsBmERR干擾會(huì)使BmHK、BmPK和BmPFK三大限速酶基因的表達(dá)顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明,BmERR可能通過(guò)影響糖酵解途代謝徑來(lái)影響家蠶的胚胎發(fā)育。(3)BmERR影響胚胎發(fā)育的分子機(jī)制為了探究BmERR作為轉(zhuǎn)錄因子是否通過(guò)調(diào)節(jié)限速酶基因啟動(dòng)子的活性來(lái)影響糖酵解限速酶的表達(dá)?本研究利用JASPAR軟件分析了BmHK、BmPK和BmPFK基因的啟動(dòng)子序列并預(yù)測(cè)了ERRE元件,在它們的啟動(dòng)子上都預(yù)測(cè)到了ERRE元件。本研究根據(jù)前面干涉和表達(dá)譜分析選擇了具相關(guān)性更好的基因BmPFK進(jìn)行了分析。首先,構(gòu)建了一系列突變不同ERRE位點(diǎn)的pGL_3-BmPFKP細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體。然后,利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),分析了調(diào)控元件對(duì)BmPFK基因啟動(dòng)子活性的影響,結(jié)果表明,ERRE-like1元件突變后,未檢測(cè)到啟動(dòng)子活性變化。然而,突變ERRE-like2元件能夠顯著降低啟動(dòng)子的活性。本研究進(jìn)一步在家蠶胚胎細(xì)胞系BmE-SWU1細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)BmERR,檢測(cè)了ERRE-like2元件對(duì)啟動(dòng)子活性的影響,結(jié)果表明ERRE-like2對(duì)啟動(dòng)子的活性有顯著上調(diào)作用。為了確定BmERR蛋白是否直接結(jié)合在BmPFK基因啟動(dòng)子的ERRE-like2元件上發(fā)揮作用,本研究將生物素標(biāo)記的ERRE-like2探針與重組BmERR DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BmERR DBD)蛋白一起孵育,通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè),結(jié)果顯示有滯后條帶;當(dāng)改變探針和蛋白的濃度時(shí),條帶信號(hào)的強(qiáng)度也隨之改變;同時(shí)加入突變時(shí),沒(méi)有出現(xiàn)滯后條帶。表明它們之間可以特異結(jié)合。同時(shí)利用ChIP實(shí)驗(yàn),也驗(yàn)證BmERR可以結(jié)合在BmPFK基因啟動(dòng)子的ERRE-like2元件。以上結(jié)果表明,BmERR可以結(jié)合在糖酵解限速酶基因啟動(dòng)子上的ERRE元件上,直接調(diào)控糖酵解限速酶基因的表達(dá),從而參與家蠶胚胎的發(fā)育。家蠶作為模型昆蟲(chóng),本研究的數(shù)據(jù)將進(jìn)一步促進(jìn)ERRs與生長(zhǎng)發(fā)育以及能量代謝之間的理解奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q418
【圖文】：

圖 1.1 家蠶的生活史[1]Figure 1.1 Life history of silkworm[1]，卵有越年卵和非越年卵之分。非越年卵產(chǎn)下天便孵化而出。但是越年卵產(chǎn)下后，約一星期入一個(gè)停滯發(fā)育的“滯育期”。胚胎在滯育期間溫度下，也不會(huì)向前發(fā)育，必須在一定的條件除后才能孵化[2-4]。滯育卵的耗氧量很低，同

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文體開(kāi)始收縮，第五至第六節(jié)腹面透明，食葉減少，排出軟糞和蠶尿，體呈蠟黃半透明狀，開(kāi)始吐絲，此時(shí)的蠶稱(chēng)為熟蠶，熟蠶即可上蔟吐絲結(jié)繭。家蠶多數(shù)種吐絲結(jié)成的繭為白色，也有吐絲結(jié)成紅色、黃色、粉紅色、藍(lán)色等彩色繭的系。經(jīng)過(guò) 2～3 天，蠶吐完絲后便在繭內(nèi)化成蛹。家蠶在蛹期要把幼蟲(chóng)的組織器加以降解、重塑最終發(fā)育為成蟲(chóng)的器官。成蟲(chóng)形成完成后，脫去蛹皮，羽化為蟲(chóng)，破繭而出。在成蟲(chóng)期，不從外界取食，具有發(fā)達(dá)的生殖器官，交配產(chǎn)卵后約經(jīng)過(guò)一星期左右自然死亡，家蠶的一個(gè)世代就此告終[6]。1.1.1 家蠶的胚胎發(fā)育過(guò)程家蠶作為鱗翅目模式昆蟲(chóng)，對(duì)家蠶的胚胎發(fā)育最早進(jìn)行研究的是 Tichomir(1886)，家蠶的卵呈橢圓形,長(zhǎng)約 1.3 mm，寬約 1.05 mm，厚約 0.6 mm，1 g 卵大有 1800-2100 粒[7]。非滯育卵胚胎的發(fā)育主要經(jīng)過(guò)受精期、原核分裂期、胚盤(pán)形期、胚帶形成期、原腸化期和反轉(zhuǎn)期等。家蠶非滯育卵胚胎發(fā)育的主要過(guò)程[8]圖 1.2。

第 1 章 文獻(xiàn)綜述賦予同時(shí)受體二聚化和 DNA 結(jié)合所必需的蛋白質(zhì)柔韌性；含有與共用的 C 末端 AF-2 結(jié)構(gòu)域的 LBD （圖 1.3A）。ERR 作為轉(zhuǎn)錄因子，RE 元件的核心序列為“GGTCA” （圖 1.3 B），同時(shí)它可以單體的形結(jié)合，也可以形成同源二聚體，還可以與其它的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成式發(fā)揮作用(圖 1.3 C )[35-37]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 沈關(guān)望;胡詩(shī)圓;王勇;吳金鑫;林英;夏慶友;;家蠶雌激素相關(guān)受體基因的克隆與表達(dá)分析[J];昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2015年12期

2 張曉燕;翟一凡;莊乾營(yíng);林清彩;吳文虎;陶玫;于毅;;昆蟲(chóng)滯育研究進(jìn)展[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年02期

3 柴春利;魯成;;從形態(tài)學(xué)不同到基因水平差異:家蠶與果蠅早期胚胎發(fā)育比較[J];遺傳;2006年09期

4 徐衛(wèi)華，佐藤行洋，山下奧亞;家蠶滯育激素基因的克隆[J];遺傳學(xué)報(bào);1995年03期

5 徐世清;;鹽酸刺激活化家蠶滯育性卵的機(jī)理研究進(jìn)展[J];江蘇蠶業(yè);1991年03期

本文編號(hào)：2805250