【摘要】：背景:生命科學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展離不開(kāi)成像儀器的開(kāi)發(fā)與成像技術(shù)的突破。如何通過(guò)成像技術(shù)來(lái)檢測(cè)、分析生物大分子的各種變化,從中提取分子信息,定性、定量這些生物大分子等都具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。AFM以微懸臂作為力學(xué)信號(hào)媒介可直觀展現(xiàn)生物大分子的超精細(xì)結(jié)構(gòu)和各種物化性質(zhì),大大提高了我們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和其在生化反應(yīng)中所扮演角色的理解,為解決生物大分子功能和分子層面生理行為的生化問(wèn)題提供了新的技術(shù)手段。目的:本研究旨在運(yùn)用多模態(tài)AFM建立生物大分子檢測(cè)與生物大分子互作研究平臺(tái)的新方法。一是開(kāi)發(fā)針對(duì)超痕量生物毒素的無(wú)標(biāo)記甄別方法;二是建立在近生理?xiàng)l件下原位動(dòng)態(tài)研究毒素生物學(xué)效應(yīng)的新平臺(tái);三是與DNA折紙技術(shù)結(jié)合,通過(guò)設(shè)計(jì)毒素-DNA標(biāo)簽嵌合分子,對(duì)室溫條件下的嵌合分子可控自組裝行為進(jìn)行前期先導(dǎo)研究,為進(jìn)一步探索毒素受體與作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:1.在超痕量生物毒素?zé)o標(biāo)記檢測(cè)部分,選用ABR,RT,ETX,BoNT/A和SEB這5種生物毒素做為模型,分別進(jìn)行提取純化,并通過(guò)APTES修飾的云母進(jìn)行表面固定,經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化使毒素蛋白在云母表面以單分子顆粒的形態(tài)沉積。首先采用AFM和PiFM對(duì)毒素單分子顆粒進(jìn)行形貌與PiF反饋的成像,并以此對(duì)基底、緩沖液中鹽成分和蛋白進(jìn)行定性。其次收集各毒素蛋白顆粒的PiF譜,參考傅里葉變換紅外吸收譜中酰胺帶的吸收峰,篩選出10個(gè)與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征PiF吸收帶,并對(duì)這些信號(hào)帶的峰位與強(qiáng)度做PCA分析。通過(guò)PCA的結(jié)果聚類每種毒素蛋白,構(gòu)建針對(duì)每種毒素蛋白的單分子PiF譜數(shù)據(jù)庫(kù)。最后混合三種毒素蛋白制作模擬樣品,并對(duì)模擬樣品進(jìn)行PiFM表征,在一定區(qū)域收集模擬樣品的PiF譜,將PiF譜導(dǎo)入先前構(gòu)建好的毒素PCA模型,最終鑒定其所包含的毒素蛋白成分。2.在生物毒素原位動(dòng)態(tài)成像研究部分,針對(duì)能夠使人血紅細(xì)胞具有成孔效應(yīng)的ETX蛋白為研究模型,通過(guò)低滲緩沖液滋洗的方式制備單層人血紅細(xì)胞外膜與內(nèi)膜,運(yùn)用環(huán)境可控的AFM平臺(tái)在近生理?xiàng)l件下原位動(dòng)態(tài)的觀察ETX與內(nèi)外膜的相互作用,表征毒素在不同溫度,不同膜區(qū)域內(nèi)成孔的特性,運(yùn)用AFM探針?lè)謩e表征完整紅細(xì)胞膜與成孔紅細(xì)胞膜的力學(xué)差異。結(jié)合重組紅色熒光mScar ETX,通過(guò)共聚焦分析ETX受體在紅細(xì)胞膜表面的分布。3.在生物毒素可控自組裝研究部分,采用重組表達(dá)的方法設(shè)計(jì)N末端含有一個(gè)Cystein殘基linker的c-linker-ETX蛋白,構(gòu)建相應(yīng)的原核表達(dá)載體行蛋白可溶性表達(dá),純化該重組c-linker-ETX,與末端修飾馬來(lái)酰亞胺的寡核苷酸序列形成1對(duì)1的蛋白-核酸嵌合體蛋白,命名為DNA-c-linker-ETX,通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)與CD實(shí)驗(yàn)對(duì)比DNA-c-linker-ETX與rETX之間有無(wú)溶血和二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。通過(guò)AFM原位觀察4種不同結(jié)構(gòu)的矩形DNA折紙(DNA origami)在室溫下自組裝的動(dòng)力學(xué)特征,探討origami缺損面積與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)其室溫下的合成與效率的影響。為研究ETX蛋白的可控組裝奠定基礎(chǔ)。結(jié)果:1.建立了超痕量生物毒素?zé)o標(biāo)記檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)表面修飾與蛋白濃度優(yōu)化,成功地在云母載片上制備了單分子毒素顆粒的樣品,AFM表征與粒徑分析均與參考蛋白結(jié)構(gòu)和分子量所做的預(yù)期相一致。其中用BoNT/A代表大分子蛋白,ABR與RT代表中等大小分子蛋白,ETX與SEB代表小分子蛋白。氣相條件下BoNT/A粒徑在10 nm左右,ABR與RT在5 nm左右,ETX與SEB在2.5 nm左右。隨后對(duì)每種毒素樣品進(jìn)行單波長(zhǎng)PiFM表征,通過(guò)云母基底PiF信號(hào)的反轉(zhuǎn)對(duì)基底上的蛋白顆粒分布進(jìn)行了定性區(qū)分。對(duì)成像區(qū)域內(nèi)的蛋白顆粒光誘導(dǎo)力譜的收集和PCA分析,將5種毒素蛋白進(jìn)行了很好的聚類,以其中ABR、RT、ETX為例制備混合模擬樣品,經(jīng)收集PiF譜和PC分析,檢測(cè)模擬樣品中三種毒素蛋白ABR:RT:ETX的信號(hào)比分別為9:35:55,該檢測(cè)值位于真實(shí)值(11:38:131)與理論值(2:3:5)之間。與傅里葉變換紅外譜相比,光誘導(dǎo)力譜在酰胺信號(hào)帶的分辨率更高且能直接顯示代表蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)歸屬的信號(hào)帶。通過(guò)對(duì)每種毒素的PiFM成像比較發(fā)現(xiàn),ETX與SEB的光誘導(dǎo)信號(hào)反饋遠(yuǎn)小于ABR,RT和BoNT/A,顯示該檢測(cè)體系對(duì)于分子量小于30 kDa的蛋白樣品檢測(cè)的不足。但可以將云母基底替換成增強(qiáng)Au基底加以改善。2.完成了對(duì)成孔蛋白ETX成孔效應(yīng)的原位動(dòng)態(tài)成像研究。Western blot實(shí)驗(yàn)與掃描電鏡提示天然狀態(tài)下ETX形成七聚體復(fù)合物與人紅細(xì)胞膜相互作用,在紅細(xì)胞膜表面成孔并破壞膜的完整性。高分辨AFM在近生理?xiàng)l件下原位觀察了人紅細(xì)胞膜孵育ETX后的形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)ETX只對(duì)人紅細(xì)胞外膜具有成孔效應(yīng),其中通過(guò)環(huán)境可控AFM的動(dòng)態(tài)成像發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于23℃時(shí)6μg/mL的rETX才使紅細(xì)胞膜外成孔,而隨著溫度下降到23℃以內(nèi),成孔效應(yīng)將停止。此外還觀察到,ETX作用下,膜的完整性隨時(shí)間而降低。通過(guò)制備“水泡”樣結(jié)構(gòu)的紅細(xì)胞膜模型,顯示ETX對(duì)于死細(xì)胞膜也具有成孔效應(yīng)。3.對(duì)基于DNA折紙術(shù)的生物毒素單體可控自組裝體系進(jìn)行了前期研究。我們成功構(gòu)建了位點(diǎn)特異性的DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,發(fā)現(xiàn)該嵌合策略不會(huì)對(duì)ETX的溶血活性及二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響;對(duì)室溫下自組裝的DNA納米結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)特征研究發(fā)現(xiàn),“接縫”結(jié)構(gòu)能引導(dǎo)短鏈完成預(yù)退火形成的缺損DNA origami的生長(zhǎng)。其正確折疊的效率與缺損的面積和預(yù)組裝的結(jié)構(gòu)相關(guān)。在“接縫”結(jié)構(gòu)存在的條件下,1/4缺損的矩形origami能夠在室溫下獲得90%的修復(fù)率。結(jié)論:本研究圍繞多模態(tài)AFM在生物大分子檢測(cè)、生物效應(yīng)和納米結(jié)構(gòu)組裝方面做出新的探索。首先,通過(guò)PiFM與PCA組合的策略,建立了蛋白毒素單分子無(wú)標(biāo)記痕量檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)ABR,RT,ETX三種混合模擬毒素的甄別,并構(gòu)建了ABR,BoNT/A,RT,ETX,SEB五種分子量不同、分子大小有別的生物毒素單分子PiF譜數(shù)據(jù)庫(kù);其次,應(yīng)用高分辨AFM在近生理環(huán)境下對(duì)ETX蛋白與人血紅細(xì)胞的成孔效應(yīng)進(jìn)行了原位、動(dòng)態(tài)的表征。AFM結(jié)果顯示在這個(gè)過(guò)程中ETX對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)膜不產(chǎn)生成孔效應(yīng),且在無(wú)ATP活動(dòng)的單層人血紅細(xì)胞膜上同樣能夠完成與膜的特異性結(jié)合。AFM對(duì)成孔紅細(xì)胞膜的高分辨成像未給出ETX七聚體復(fù)合物是構(gòu)成紅細(xì)胞膜表面孔洞的直接證據(jù)。最后,基于DNA折紙術(shù)設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,為下一步定量,可控的研究ETX七聚體在成孔過(guò)程中的角色提供了有力的工具,也為下一步研究生物大分子在生理?xiàng)l件下與origami的定向排列與功能驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q-336
【圖文】：

圖 1AFM 工作示意圖a）典型的力-距離曲線示意圖，反映了探針與樣品表面的相互作用力，通過(guò)施加于針尖的 F 可以計(jì)算出樣品的彈性模量 E；b）AFM 工作狀態(tài)下探針針尖的力曲線示意圖；c）輕敲模式下 AFM 探針掃描樣品表面，實(shí)時(shí)獲得力反饋。基于不同的應(yīng)用需要，AFM 發(fā)展出靜態(tài)的成像模式（也稱為接觸）模式和各種動(dòng)態(tài)（非接觸或 輕敲 ）模式：1，輕敲模式 AFM，通過(guò)使用處于振動(dòng)狀態(tài)的探針針尖對(duì)樣品表面進(jìn)行敲擊來(lái)生成形貌圖像。掃描過(guò)程中，探針懸臂的振幅隨樣品表面形貌的起伏而變化，從而反映出形貌的起伏。其優(yōu)點(diǎn)是消除了會(huì)對(duì)樣品造成損傷并降低圖像分辨率的橫向力影響，并且可以不受成像環(huán)境下樣品表面附著的水膜的影響。缺點(diǎn)是掃描速度比接觸模式稍慢一些。2，接觸模式 AFM，探針針尖始終與樣品表面保持接觸。當(dāng)掃描管引導(dǎo)針尖在樣品上方掃過(guò)（或樣品在針尖下方移動(dòng)）時(shí)，懸臂梁受力發(fā)生彎曲，從而反映出形貌的起伏。其優(yōu)點(diǎn)是可以達(dá)到很高的分辨率，缺點(diǎn)是有可能對(duì)樣品表面造成損壞，橫向的剪切力和表面

和產(chǎn)氣莢膜溶血素(Perfringolysin O)研究較為深入。Shao 等通過(guò) AFM 對(duì)霍亂毒素和產(chǎn)氣莢膜溶血素在磷脂層上自組裝成像使我們可以直觀的看到霍亂毒素 5 個(gè) β亞基聚體中間約2 nm的孔洞（圖2 a）；PFO的成像對(duì)膽固醇依賴性溶細(xì)胞素（CDCs）的成孔前體的跨膜機(jī)制帶來(lái)直接證據(jù)[18,19]（圖 2 b）。圖 2 成孔毒素在磷脂層成孔的 AFM 成像a）磷脂雙分子層上的霍亂毒素 B 亞單位五聚體 AFM 成像[18]；b）磷脂雙分子層上的產(chǎn)氣莢膜溶素（PFO）孔復(fù)合物 AFM 成像[19]PFO 作為 CDCs 成孔的模型的代表，其成孔機(jī)制已研究的較為清楚，F(xiàn)eil 等

圖 3 PFO 與 ETX 單體晶體結(jié)構(gòu)PFO 具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域 D1，D2，D3，D4；ETX 具有 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域 D1，D2，D3如圖 4 所示，近年來(lái)利用 DNA 分子組裝納米形狀和圖案被用來(lái)制造納米工具被越來(lái)越多的應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域[28-30]。模塊化的 DNA 單元通過(guò)與功能化的蛋白質(zhì)嵌合，可以在相對(duì)獨(dú)立的體系內(nèi)定性定量的展示單分子蛋白的生化信息，比如轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 的結(jié)合[31]，酶對(duì)核酸的剪接[32]和單體蛋白的功能性聚合[33]在這些例子當(dāng)中DNA鏈為蛋白質(zhì)提供了機(jī)械剛性和相對(duì)較高的物理化學(xué)穩(wěn)定性此外通過(guò)引入各種酶切位點(diǎn)，利用一系列高度特異性的 DNA 酶，就能夠間接地的處理和操縱嵌合分子，并通過(guò) AFM 予以表征。

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