【摘要】：生殖是生物最基本的特征之一,是生物適應(yīng)與進(jìn)化的基礎(chǔ)。生物的生殖包括兩種方式,即無性生殖(asexual reproduction)與有性生殖(sexual reproduction)。而在真菌中,由于存在著極其多樣化的生殖特征,現(xiàn)在已成為研究的熱點,目前有關(guān)有性生殖進(jìn)化和維持機(jī)制方面的研究知之甚少,相關(guān)物種的生殖模式、發(fā)生有性生殖的機(jī)制和相關(guān)信號通路、誘導(dǎo)有性生殖的內(nèi)在和環(huán)境因素等,也一直是一個懸而未決的問題。因兼具多種生殖模式,圓盤菌科真菌已經(jīng)成為了研究真菌有性生殖機(jī)制的理想模型。在課題組分離和保存了圓盤菌科多種能進(jìn)行有性生殖模式個體的基礎(chǔ)上,本論文擬以交配型基因為靶標(biāo),通過對交配型基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和基因功能進(jìn)行初步研究,旨在為理解圓盤菌科真菌有性生殖的進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)提供有價值的線索。主要研究結(jié)果如下:1.對包括圓盤菌科六個代表屬節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)、小德氏霉屬(Drechslerella)、亞隔指孢屬(Dactylellina)、隔指孢屬(Dactylella)、雙頭盤菌屬(Dicranidion)、圓盤菌屬(Orbilia),15株菌進(jìn)行了全基因組重測序、經(jīng)組裝和分析后注釋了所有測序真菌的交配型基因位點(mating type locus),交配型基因大小在1445～4378 bp,編碼434～1142個氨基酸,內(nèi)含子1-7個不等,確認(rèn)同宗配合真菌兩種,異宗配合真菌兩種。2.對交配型基因序列進(jìn)行了種間和種內(nèi)差異性分析,發(fā)現(xiàn)交配型基因一級結(jié)構(gòu)在種內(nèi)是保守的,在種間隨著物種的不同存在顯著差異。通過對交配型基因位點的結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)交配型基因上游相對保守,而下游基因卻存在著大量的易位和倒置;并對不同物種交配型基因二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其存在保守的二、三級結(jié)構(gòu),編碼相同的蛋白質(zhì)家族HMG-domain,即MAT1-2交配型位點的核心蛋白;更進(jìn)一步的選擇壓力分析顯示,交配型基因受到的選擇壓力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于看家基因,在不同生殖模式中,兩種交配型基因受到的選擇壓力各不相同,MAT1-2基因在同宗配合真菌中受到的選擇壓力是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于異宗配合真菌,MAT1-1基因在不同生殖模式中受到的選擇壓力相同;基于上述研究結(jié)果我們支持“交配型基因MAT1-1是由MAT1-2進(jìn)化而來”這一假說。系統(tǒng)發(fā)育研究展示了交配型基因和核基因具有不同的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),表明交配型基因和看家基因有著較大程度的分化,極有可能是交配基因受到更大的選擇壓力影響導(dǎo)致,這種系統(tǒng)發(fā)育拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上的差異在座囊菌綱(Dothideomycetes)和錘舌菌綱(Leotiomycetes)極為明顯。3.以A.oligospora為研究對象,基于全國范圍內(nèi)采集的96株菌,分別擴(kuò)增了 MAT1-1、MAT1-2、ITS、RPB2、β-tub五個基因,其中擴(kuò)增出 MAT1-1 菌株47株,MA"H-2菌株49株,比例接近1:1,存在有性生殖的可能,并按照MAT1-1和MAT1-2基因的不同將所有菌株分為兩個類群,進(jìn)行了群體遺傳學(xué)的分析,利用單基因構(gòu)樹和多基因聯(lián)合構(gòu)樹發(fā)現(xiàn) A.oligospora分為三個支系,與之前的研究相同,存在明顯種內(nèi)分化,單基因和多基因聯(lián)合構(gòu)樹顯示樣品的聚類和地理分布關(guān)系不大,STRUCTURE分析得知MAT1-1類群分為四個群體結(jié)構(gòu),而MAT1-2類群分為兩個群體結(jié)構(gòu),整個A.oligospora類群存在種群分化;兩個類群群體貢獻(xiàn)均為種群內(nèi)部變異的貢獻(xiàn)大于種群間貢獻(xiàn),存在群體間的基因流,連鎖不平衡分析和系統(tǒng)發(fā)育不相容分析表明,在種群內(nèi)部存在隨機(jī)重組,基于上述研究,多證據(jù)表明A.oligospoA 種群內(nèi)部極可能存在有性生殖,隨后我們用多種培養(yǎng)基在不同條件下進(jìn)行了該類真菌有性生殖的誘導(dǎo),并未成功誘導(dǎo)出其有性生殖結(jié)構(gòu),通過測序檢測也并未發(fā)現(xiàn)重組,但是對不同誘導(dǎo)時期的樣品提取RNA后進(jìn)行MAT1-1基因的cDNA擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)該基因的轉(zhuǎn)錄,暗示著該類真菌的有性生殖還受到其他多種因素的控制。4.為了進(jìn)一步的研究交配基因是否參與菌絲的生長、孢子的發(fā)育或具備其他生物學(xué)功能,我們以尿嘧啶缺陷型釀酒酵母為載體細(xì)胞,通過電轉(zhuǎn)的方法成功構(gòu)建了A.oligosp A 兩個交配型基因的敲除載體,并以CaC12-PEG介導(dǎo)的方法成功獲得了A.oliospora △MAT1-1敲除株,分別比較了野生型和敲除株的生長速率、抗逆性、孢子形態(tài)及數(shù)量和產(chǎn)捕器能力,實驗結(jié)果表明,在生長速率和產(chǎn)捕器能力上野生型和敲除株無明顯差異,但是在孢子的形態(tài)、數(shù)量和抗逆性上具有統(tǒng)計學(xué)上意義,表明該基因可能影響著該科真菌的無性生活史。
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q935
【圖文】：

云南大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑制；由兩個獨立遺傳因子控制的交配稱為四極性交配系統(tǒng)，由信息素和其受體逡逑基因和編碼轉(zhuǎn)錄因子的ｂ基因控制。人類致病擔(dān)子菌新隱球菌（ＣＶ＾ｐｒｏｃｏｃｃｗｓ逡逑ｏ／ｏｍｗｗ）信息素和其受體都存在于兩個相反的交配型菌株中，因此我們認(rèn)為在逡逑子菌中，同宗配合真菌和異宗配合真菌都同時含有信息素和其受體［１２，２６，２７］。逡逑ａｔｉｎｇ邋ｔｙｐｅ邋ｌｏｃｕｓ是控制子囊菌和擔(dān)子菌有性生殖的重要基因調(diào)控位點，但并不逡逑所有真菌都存在這一調(diào)控系統(tǒng)，接合菌門中，更小的一種有機(jī)分子三孢子酸作逡逑信息素，完全不同于子囊菌和擔(dān)子菌中的信號肽，在壺菌綱中，涉及到的是一逡逑列化學(xué)物質(zhì)，如異水霉雌性菌株產(chǎn)生雌激素，雄性菌株逡逑生雄激素［２８］。逡逑ｍａｔｉｎｇ，邋ｔｙｐｅ邋１邐ｍａｔｉｎｇ邋ｔｙｐｅ邋２逡逑

產(chǎn)其他捕器的真菌與不產(chǎn)捕器的真菌分別聚類在一起形成兩個獨立的支系。逡逑ｌｒ＞ｃｉｎ邋ｔ0ｅ？？Ｋ＊ｒ邐Ｃｒ＊？？？邋Ｔｒａｃｋ邋ｌ－ｉ＊？逡逑ＪＯ邐２？０邋０Ｃ０邐２Ｓ０．０９Ｃ邐３９０．００Ｓ邐ＳＳＣ．９ＳＣ邐－ｔＱＣ邋＆ａＣ邐４Ｅ０Ａ０Ｃ邐５Ｓ８．００Ｓ逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐V邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑２？４Ｓ＿Ｍ７Ｌ邋５７０ＭＸＸ＿Ｌ邋１＿１．逡逑Ｔ４0．ＳＣｉ邋ｆ？＊０？逡逑？？＊－？邋？？？＜＞＞邋？？？＊，》＞？＊邋、ｖ．？邋？＊＞．？邐ｔｖｔ＊逡逑ａ？？ＡＭｉ邐＞？0．？0？邐ｚｒｓ＾ｅｅ邐？？ｅ邋ｓｅｅ邐ａ？？ａ＊ｅ邐？ｔ0ｊ＞ｅ？邐ｕｓａｏｏ邐？ａ？．９９ｅ逡逑＜邐ｉ邐＜邐ｔ邐ｉ邐ｘ邐ｉ邐？邐＜逡逑？Ｔ４＊．ｗｎ．？．？ｏｔ？ｅｘ＊．．？■＞．？逡逑圖邋２＿１：邋Ｒｅａｄｓ邋的邋Ｍａｐｐｉｎｇ邋組裝逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１：邋Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ邋ｒｅａｄｓ逡逑Ｋ邋ｍａｒ邋ｌ＇ｒ？＾ｕｔ�。�？４Ｃｙ邋Ｏ邋？？邋ｊｆｃ？Ｍｉｊｎｎ逡逑？９邋丨邋＂＂邋；邋．■■■■ｆｌ．￣．－—ｙ■一邋．廣．邋－？邋．■…．＞■—邋－．邋逡逑

２．邋２交配基因的檢索與分析逡逑基于基因組和真菌交配型基因的結(jié)構(gòu)特征，我們通過本地Ｂｌａｓｔ進(jìn)行本地檢逡逑索，找到交配型基因可能存在的Ｓｃａｆｆｏｌｄ，并對Ｓｃａｆｆｏｌｄ進(jìn)行了基因預(yù)測，預(yù)測逡逑出的基因在在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對查找，ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入對應(yīng)氨基酸序列，能逡逑夠檢索出真菌交配型基因詞條，并能檢索出相應(yīng)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，在ＥＢＩ數(shù)據(jù)庫逡逑Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ邋（非冗余蛋白）進(jìn)行檢索，能夠得到注釋信息為ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ家族的逡逑Ａｌｐｈａ－ｂｏｘ邋和邋ＨＭＧ－ｂｏｘ邋的注釋結(jié)果，如圖邋２－４、２－５0逡逑基于基因預(yù)測和數(shù)據(jù)庫比對后，我們確定了所有重測序菌株的交配型基因，逡逑其中在兩株不同的Ａ邋ｏ／／ｇａｓｐｏｒａ、ＩＶ．邐菌株中分別發(fā)現(xiàn)了邋ＭＡＴ１－１和逡逑ＭＡＴ］－２，在兩個菌株ＯＭ／ｆｌｓｐ．中同時發(fā)現(xiàn)ＭＡＴ１－１和ＭＡＴ１－２，確定了圓盤菌逡逑科三種真菌的交配類型，在剩余的６個物種內(nèi)由于菌株數(shù)量有限，只發(fā)現(xiàn)了其中逡逑一種交配型基因。最小的交配型基因是存在于Ｚ）／ｃｒａ？／＜ｉ／ｏ？７邋ｓｐ．邋ＹＭＦ１．０３０２４中的逡逑ＭＡＴ１－１有４３４個氨基酸，存在兩個內(nèi)含子；最大的交配型基因是Ａｏ／／ｇ（ｗｐ0７－0逡逑

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本文編號：2782388