【摘要】：非生物脅迫對植物生長有明顯影響,其中高溫脅迫嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量。研究植物高溫應(yīng)答分子機(jī)制對于農(nóng)作物改良具有重要意義。菠菜(Spinacia oleracea L.)是耐冷不耐熱的蔬菜,在我國北方廣泛種植。菠菜不適合長距離運(yùn)輸,導(dǎo)致夏季南方菠菜供應(yīng)不足,培育耐熱菠菜品種并在南方推廣種植具有重要意義。我們培育了菠菜耐熱材料Sp75,并開始利用分子生物學(xué)手段研究菠菜高溫應(yīng)答機(jī)制。促絲裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)信號通路在植物發(fā)育與高溫應(yīng)答過程中都具有重要作用。該通路由逐級激活的三級激酶MAP3K、MAP2K和MAPK通過順序磷酸化發(fā)揮功能。菠菜基因組中有35個(gè)MAP3K和5個(gè)MAP2K,其高溫應(yīng)答模式和相互調(diào)控關(guān)系并不清楚。本研究在全基因組范圍內(nèi)分析了SpoMAP3K家族的35個(gè)成員,其與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、甜菜(Beta vulgaris L.)、藜麥(Chenopodium quinoa Willd)、南瓜(Cucurbita moschata L)、筍瓜(Cucurbita maxima Duch.)、黃瓜(Cucumis sativus L)等植物的MAP3K蛋白同源性較高,該蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域、磷酸化功能位點(diǎn)、半胱氨酸位點(diǎn)都較為保守。我們克隆了SpoMAP3K家族中SpoRaf28基因,其最大開放閱讀框?yàn)?101bp,共編碼366個(gè)氨基酸。利用煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),對SpoRaf28進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。熒光定量PCR分析表明,高溫脅迫下在菠菜熱敏感材料Sp73中SpoRaf28基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異,而在耐熱型材料Sp75中,SpoRaf28基因表達(dá)量顯著上升。菠菜材料Sp75在六葉期和抽薹期SpoRaf28基因表達(dá)量在不同組織器官中表達(dá)量差異明顯,兩種時(shí)期均在葉片表達(dá)量最高。菠菜材料Sp75經(jīng)37℃高溫處理72h后,葉片明顯發(fā)生萎蔫現(xiàn)象,SpoRaf28基因表達(dá)量呈上升趨勢,但在不同鹽堿(NaCl、Na_2CO_3、NaHCO_3)與重金屬(CdCl_2)脅迫條件下,葉片表型無明顯現(xiàn)象,SpoRaf28基因表達(dá)量下降,這表明SpoRaf28受到高溫誘導(dǎo),但是受鹽和重金屬脅迫抑制。37℃高溫處理下,過表達(dá)SpoRaf28基因的酵母菌株和擬南芥植物的生長都受到促進(jìn),這表明SpoRaf28在高溫應(yīng)答過程中起正調(diào)控作用。酵母雙雜交試驗(yàn)的結(jié)果表明SpoRaf28與SpoMAP2Ks不相互作用。我們的結(jié)果表明,SpoMAP3K家族成員SpoRaf28在菠菜高溫應(yīng)答信號通路中起到了正調(diào)控作用,為研究MAPK級聯(lián)途徑的分子調(diào)控機(jī)理提供了新的證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;S636.1
【圖文】：

利用 Primer5 設(shè)計(jì)基因全長特異性引物。以菠菜 Sp75 的 cDNA 為模板對 SpoRaf28 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（圖3-2），將 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接克隆載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，將大腸桿菌菌液送生物公司測序。測序結(jié)果比對顯示與基因組預(yù)期結(jié)果吻合。圖 3-1 菠菜 Sp75 葉片總 RNA 凝膠電泳圖譜Fig.3-1 Total RNA of Sp75 leaves28S rRNA18S rRNA

第 3 章 結(jié)果 上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2.3 SpoMAP3K 蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育分析從菠菜基因組數(shù)據(jù)庫中找到菠菜 MAP3K 家族的 35 個(gè)同源蛋白。通過蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，如圖 3-5 所示，在陰影部分有 4 個(gè)蛋白與菠菜Spo04124（SpoRaf28）最同源，菠菜 Spo04124 與 Spo10743、Spo02347、Spo16751、Spo19902 蛋白親緣關(guān)系最近，同源性最高。

293.2.4 SpoRaf28 的親疏水性分析利 用 ExPASy 數(shù) 據(jù) 庫 提 供 的 計(jì) 算 親 疏 水 性 分 布 的 ProtScale 工 具（https://web.expasy.org/protscale/），對 SpoRaf28 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，如圖 3-6 可知，其中正值為疏水性，負(fù)值為親水性，結(jié)果顯示 SpoRaf28 蛋白具有明顯的親水性；結(jié)合亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果（https://rostlab.org/services/loctree3/），判斷其編碼蛋白可能位于細(xì)胞質(zhì)中。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張秋楠;菠菜SpoRaf28基因克隆及其高溫應(yīng)答功能分析[D];上海師范大學(xué);2019年

本文編號：2752240