【摘要】：電化學發(fā)光(ECL)是一種由電化學反應所引起的高能電子轉(zhuǎn)移的化學發(fā)光現(xiàn)象。ECL將電化學和化學發(fā)光兩種檢測技術(shù)相結(jié)合,具有線性范圍寬、背景信號低、可控性高和選擇性好等特點。在分析化學研究領(lǐng)域中,ECL已成為一種強有力的檢測手段。使用ECL技術(shù)進行細胞分析或細胞成像時,由于細胞在常規(guī)電極上存在空間位阻,使得細胞覆蓋區(qū)域的ECL反應很難發(fā)生或不能充分進行,這限制了ECL技術(shù)在細胞分析中的應用。為此,本文借助于通透性基底建立了無細胞空間位阻的ECL分析方法,并應用到ECL細胞傳感和單細胞ECL成像分析。主要內(nèi)容如下:1.殼聚糖膜修飾電極上單細胞直接ECL成像單細胞成像技術(shù)能夠在單細胞水平上準確地反映出細胞之間的異質(zhì)性,該技術(shù)在闡明細胞的相關(guān)功能及生物學機制時起到至關(guān)重要的作用。電化學發(fā)光(ECL)顯微成像技術(shù)憑借其高通量和零細胞背景光的特點,一直被認為是一種非常有用的細胞研究工具。然而,由于細胞固定在電極表面之后,電極上細胞的空間位阻和細胞膜的高度絕緣性使得細胞的ECL成像很難實現(xiàn)。為了解決這個問題,我們制備了殼聚糖膜和納米二氧化鈦修飾的FTO電極(FTO/TiO2/CS),并在該電極上成功實現(xiàn)了單細胞的直接ECL成像。具有通透性的殼聚糖膜不僅有利于活細胞的貼壁,還增加了細胞底部和電極之間的距離。殼聚糖膜抬升了細胞之后,使得更多的ECL試劑進入細胞下方,從而提高了定量分析的靈敏度。電極上納米二氧化鈦的修飾,可以增強電極在魯米諾溶液中可視化的ECL信號,提高細胞成像時的信噪比�；贔TO/TiO2/CS電極,建立了ECL光強和過氧化氫濃度的關(guān)系,并在單細胞水平上分析了藥物刺激下的過氧化氫釋放情況。據(jù)我們所知,我們的工作首次實現(xiàn)了沒有細胞空間位阻的單細胞ECL成像。并且為傳統(tǒng)的電極修飾技術(shù)應用到電化學發(fā)光可視化分析,尤其是細胞ECL成像分析提供了新思路。2.基于石墨烯水凝膠的ECL傳感器對骨骼肌細胞表面GLUT4表達水平分析細胞表面受體的原位檢測是近年來研究的熱點。本文提出了一種靈敏檢測人骨骼肌細胞(HSMC)表面葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)表達的電化學發(fā)光方法。石墨烯水凝膠(GH)作為可滲透電極,能夠克服細胞-電極間空間位阻,增加了細胞表面受體分析的準確性。將碳點(CDs)標記到細胞上后,可以在GH與細胞界面(細胞下表面)產(chǎn)生ECL發(fā)射,細胞表面大約一半的GLUT4可以得到檢測。所制備的GH細胞傳感器對HSMC細胞表現(xiàn)出良好的分析能力,可以檢測出500～1.0 × 106 cells·mL-1濃度范圍內(nèi)的HSMC細胞,檢出限可達200 cells·mL-1。通過計算,平均每個HSMC細胞表面表達1.88 × 105個GLUT4分子。此外,在胰島素的作用下,HSMC表面的GLUT4表達水平提高了2.3倍。該策略可對細胞表面的受體進行合理評估,從而推動ECL在疾病診斷中的應用。3.電位分辨ECL同時評估兩種細胞表面受體及單個凋亡細胞的可視化診斷單細胞分析有助于我們深入理解細胞行為和細胞間通信,能夠為現(xiàn)代生物學和醫(yī)藥學的研究提供許多細節(jié)信息。本實驗開發(fā)了一種電位分辨電化學發(fā)光(ECL)方法,并將其用于凋亡細胞的診斷。白藜蘆醇(RVL)處理MCF-7細胞之后,細胞表面表皮生長因子受體(EGFR)表達水平降低。同時,RVL可以誘導細胞凋亡,促進細胞膜上磷脂酰絲氨酸(PS)外翻,細胞表面PS表達增多。本實驗以Au@L012和g-C3N4作為ECL探針,并分別用表皮生長因子(EGF)和肽段(PSBP)進行功能化,之后與細胞表面的EGFR和PS進行識別結(jié)合。兩種ECL探針在同一電位掃描過程中呈現(xiàn)出兩個峰電位充分分離的ECL信號。Au@L012和g-C3N4的ECL變化反映著細胞凋亡程度,這為研究細胞凋亡提供了新的途徑。重要的是,該方法可以同時評估細胞表面EGFR和PS的表達水平,并可以在ECL顯微鏡下實現(xiàn)單個凋亡細胞的可視化診斷。該策略有助于腫瘤標志物的可視化研究,推動ECL成像技術(shù)在單細胞水平上診斷疾病的應用。
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q2-33;O657.1
【圖文】：

Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＷＣＮＴ－ｂａｓｅｄ邋ＥＣＬ邋ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ逡逑燦等＿就利用ＣＱＤｓ設(shè)計了針對癌胚抗原（ＣＥＡ）免疫檢測的ＥＣＬ傳感器。逡逑如圖１－５，他們將四環(huán)素酸（ＰＴＣＡ）以非共價的方式修飾到石墨烯上，然后與ＣＱＤｓ逡逑和邋ＡｕＮＰｓ復合，形成ｇｒａｐｌｉｅｎｅ－ＰＴＣＡ－Ｃｕ２—－ＣＱＤｓ／ＡｕＮＰｓ納米復合物。ＰＴＣＡ和逡逑ＣＱＤｓ在共反應劑Ｓ２0８２－中起協(xié)同作用，提高ＥＣＬ強度。ＡｕＮＰｓ連接二抗Ａｂ２后，逡逑可以被捕獲到己經(jīng)負載一抗ＡｂｊＰＣＥＡ的電極上，構(gòu)成針對ＣＥＡ檢測的夾心免疫逡逑傳感器。此傳感器可以對１邋ｘ邋ｌ0＿３￣ｌ邋ｎｇ＇ｍＬ－１的濃度范圍內(nèi)的ＣＥＡ進行靈敏檢測，逡逑檢出限可達２．６ｘｉ0４邋ｆｇｍＬ－ｉ。在對各種癌癥樣品檢測實驗中，體現(xiàn)出較好的特逡逑異性識別能力。逡逑疆＿美媝逡逑Ｇｒａｐｈｅｎｅ逡逑ｅｔ逡逑ｔ邐ｔ邐ＨＡｕＣｌｆ逡逑圖１－５邋ＥＣＬ免疫傳感器的構(gòu)建及ＣＥＡ的檢測原理Ａ逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＥＣＬ邋ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ邋ａｎｄ邋ＥＣＬ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．逡逑７逡逑

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本文編號：2727566