【摘要】：蔬果類(lèi)發(fā)酵腌制食品可以通過(guò)微生物主導(dǎo)的亞硝酸鹽酶降解和酸降解兩種途徑降低亞硝酸鹽濃度。酸降解的研究較為透徹,廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品乳酸菌直投生產(chǎn)中。然而,酸降解不能消除過(guò)量農(nóng)業(yè)氮肥施用造成的蔬果內(nèi)高濃度的硝酸鹽。這些硝酸鹽進(jìn)行人體后可被棲息于中性腸道的微生物還原,形成二次亞硝酸鹽危害。因此,蔬果發(fā)酵腌制過(guò)程中,硝酸鹽和亞硝酸鹽的微生物酶降解機(jī)制的解析和應(yīng)用具有重要意義。本論文以東北酸菜為對(duì)象進(jìn)行發(fā)酵腌制模擬實(shí)驗(yàn),參考氮素的生物化學(xué)地球循環(huán)途徑和特征,通過(guò)對(duì)東北酸菜固體和發(fā)酵液液體理化性質(zhì)、微生物轉(zhuǎn)化氮素的功能基因豐度和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),明確東北酸菜腌制過(guò)程中亞硝酸鹽酶降解的微生物途徑和類(lèi)群。同時(shí),參考發(fā)酵液中酶降解底物的類(lèi)型設(shè)計(jì)相應(yīng)微生物特異性培養(yǎng)基分離具有酶降解功能的微生物菌株。最后進(jìn)行多菌株的復(fù)合直投的初步試驗(yàn)。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)東北酸菜發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽酶降解途徑研究。實(shí)驗(yàn)室模擬東北酸菜發(fā)酵條件進(jìn)行了37天的連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。通過(guò)東北酸菜發(fā)酵液pH的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)將亞硝酸鹽降解過(guò)程分為以酶降解為主的階段(1-15天)和以酸降解為主的階段(17-37天)。采用顯色法、離子色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中氮素化合物(銨鹽、亞硝酸鹽與硝酸鹽)濃度的動(dòng)態(tài)變化。在酶降解階段,亞硝酸鹽濃度先逐漸升高,并在7天達(dá)到超過(guò)國(guó)標(biāo)的峰值31.29mg/kg,然后下降至0.42 mg/kg。同時(shí),檢測(cè)到整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中銨鹽濃度變化較小且濃度遠(yuǎn)低于同時(shí)期的亞硝酸鹽濃度,推測(cè)東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽酶降解來(lái)源于微生物的反硝化作用。基于反硝化功能基因nir的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),驗(yàn)證了上述結(jié)果同時(shí)明確了具有nirSC_1基因型、nirKC_5基因型與nirKC_2基因型的微生物類(lèi)群在東北酸菜酶降解過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)高效液相法測(cè)定反硝化作用底物有機(jī)酸結(jié)果表明,酸菜發(fā)酵前期反硝化微生物類(lèi)群最可能利用的碳源包括草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸、酒石酸、乳酸8種。(2)東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽酶降解微生物類(lèi)群解析。通過(guò)構(gòu)建東北酸菜不同時(shí)期發(fā)酵液樣品的高通量測(cè)序文庫(kù),對(duì)發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了解析�；诩�(xì)菌OTU的文庫(kù)稀釋曲線、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)PCoA分析和物種注釋等結(jié)果均表明東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯演替過(guò)程。在亞硝酸鹽酶降解階段,假單胞菌目(Pseudomonadales)的假單胞菌屬(Pseudomonas),乳桿菌目(Lactobacillales)的明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏屬(weissella),以及腸桿菌目(Enterobacteriales)未知新種細(xì)菌最為優(yōu)勢(shì),且這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群相對(duì)豐度伴隨發(fā)酵液中硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度的動(dòng)態(tài)變化而改變,是東北酸菜發(fā)酵前期亞硝酸鹽酶降解階段關(guān)鍵微生物類(lèi)群。(3)硝酸鹽和亞硝酸鹽酶降解微生物分離和鑒定。以硝酸鹽和亞硝酸鹽作為氮源底物,以上述8種有機(jī)酸混合作為碳源電子供體,以有氧和無(wú)氧為限制條件,培養(yǎng)分離得到發(fā)酵液中具有同時(shí)降解硝酸鹽與亞硝酸鹽能力的細(xì)菌菌株133株。經(jīng)過(guò)反硝化能力檢測(cè)確定來(lái)自腸桿菌目(Enterobacteriales)的腸桿菌屬Enterobacter、金黃桿菌Chryseobacterium、勞特菌屬Raoultella和歐文氏屬Kluyvera,乳桿菌目(Lactobacillales)的腸球菌屬和明串珠菌屬的細(xì)菌菌株,具有同時(shí)降解硝酸鹽和亞硝酸鹽能力。另獲得2株腸桿菌屬和1株金黃桿菌屬的新種菌株。(4)雙重還原功能菌株的直投發(fā)酵應(yīng)用。從安全性出發(fā)選擇明串珠菌菌株Leuconostoc citreum FXLB-3S2和腸球菌Enterococcus casseliflavus NXBC-1S2作為同時(shí)具有硝酸鹽和亞硝酸鹽酶降解能力的菌株。輔助分離得到的乳桿菌Lactobacillus plantarum PXLB-1S1進(jìn)行單菌直投與復(fù)合直投發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。直投結(jié)果表明復(fù)合發(fā)酵可將東北酸菜固體硝酸鹽降解率由75%提高至84%,液體中硝酸鹽降解率可達(dá)48%,且發(fā)酵過(guò)程中無(wú)亞硝酸鹽積累。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS255.53;TS201.3
【圖文】：

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文1.2 亞硝酸鹽相關(guān)的微生物氮素循環(huán)亞硝酸鹽是氮素生物地球化學(xué)循環(huán)的中心，其生成與降解途徑多種多樣，作用微生物也多種多樣。生物地球化學(xué)循環(huán)中的氮素循環(huán)途徑中，不同生成降解和途徑中關(guān)鍵基因不同，反應(yīng)底物與產(chǎn)物也均不相同。其中亞硝酸鹽可能經(jīng)過(guò)以下 4 種微生物代謝途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化：1、反硝化作用（Denitrification）；2、硝酸鹽氨化作用（Dissimilatorynitrate reduction to ammonium, DNRA）；3、厭氧氨氧化作用（Anammox）；4、硝化作用（Nitrification），反應(yīng)式如圖 1.1[22]。

北酸菜發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽微生物酶降解機(jī)制及應(yīng)對(duì)其他微生物的生長(zhǎng)有抑制作用，從而忽略養(yǎng)基的設(shè)計(jì)是解析酸菜發(fā)酵過(guò)程中酶降解位較低，在微生物代謝過(guò)程中極易成為電子鹽、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)氮素釋放（圖 1.2同有機(jī)酸鹽作為碳源，硝酸鹽、亞硝酸鹽作東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸、硝酸鹽、亞硝底物是酸菜發(fā)酵系統(tǒng)中微生物可利用的多種培養(yǎng)基可準(zhǔn)確地分離酸菜發(fā)酵液中的亞硝酸

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2715494