【摘要】：第一部分 表達CTLA-4抗體的重組流感病毒構建及篩選背景:原發(fā)性肝癌(HCC)是全世界范圍內的惡性腫瘤之一,世界范圍內死亡率居第三位,而在亞洲其死亡率居第二位。盡管科學家們不斷探索研究治療腫瘤的方法,但由于腫瘤細胞增長迅速,易侵襲周圍組織等,就目前為止其治愈率并未顯著的提高。因此,尋找新的治療肝癌的方法一直是人類面臨的挑戰(zhàn)。越來越多的研究表明,溶瘤病毒可選擇性地靶向性癌細胞而對正常細胞無明顯影響,細胞毒性T淋巴細胞相關抗-4(CTLA-4)可靶向T細胞中的調節(jié)途徑,增強抗腫瘤免疫應答,因此,研究表達CTLA-4抗體的溶瘤病毒對癌癥治療方面有重要作用。目的:拯救表達免疫檢查點muCTLA-4抗體的重組流感病毒,并對其進行全面鑒定。方法:(1)在A/Puerto Rico/8/34(PR8)流感病毒的PB1上構建muCTLA-4的抗體重鏈、PA上構建muCTLA-4的抗體輕鏈,與流感病毒PR8的6個質粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共轉染COS-1、MDCK細胞,收集細胞上清,將其接種于SPF雞胚、超濾濃縮、純化等步驟獲得重組溶瘤流感病毒,命名為rFlu-muCTLA-4;(2)通過電鏡觀察重組溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的形態(tài)與大小分布、血凝試驗、EID_(50)、PCR等方法對rFlu-muCTLA-4進行全面鑒定;(3)重組溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4經(jīng)純化、濃縮、離子交換后,利用ELISA實驗測定rFlu-muCTLA-4中anti-CTLA-4抗體的含量。結果:(1)經(jīng)透射電鏡觀察rFlu-muCTLA-4多數(shù)為球形,表面有棘突,其顆粒直徑約在80~120nm之間,表明重組溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的病毒形態(tài)和顆粒大小分布符合流感病毒典型特征;(2)收取陽性尿囊液,經(jīng)血凝檢測為陽性,rFlu-muCTLA-4的血凝效價為2~(9~10);rFlu-muCTLA-4的EID_(50)為10~(-8) EID_(50)/mL、重組溶瘤病毒rFlu-muCTLA-4的PB1、PA基因片段與預期大小一致。(3)分別收取接種重組病毒rFlu-muCTLA-4第2、3、4天的雞胚,經(jīng)蛋白純化,可檢測到anti-CTLA-4抗體。結論:本實驗成功構建了一株表達免疫檢查點抑制劑muCTLA-4抗體的重組流感病毒,并完成對該病毒的初步鑒定,為下一步的體內、外實驗提供一定的基礎依據(jù)。第二部分 表達CTLA-4抗體的重組流感病毒治療H22肝癌細胞的體內、外實驗研究目的:評價構建的重組溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4對小鼠H22肝癌的治療效果。方法:(1)體外實驗,采用MTS方法檢測溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4對H22細胞株的殺傷作用,并檢測r Flu-mu CTLA-4對H22細胞的毒性;(2)體內實驗:通過建立Balb/c小鼠肝癌H22細胞皮下種植模型,觀察并評價溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4對腫瘤的抑制和延長生存情況。(3)小鼠治療后,眼球取血,收集血清,通過血凝抑制實驗(HI)檢測小鼠產(chǎn)生的保護性抗體情況。結果:MTS檢測結果顯示,1.0 MOI的重組病毒P=0.0307(P0.05)、2.0 MOI的重組病毒P=0.0017(P0.01),5.0 MOI的重組病毒P=0.0011(P0.01),2.0 MOI、5.0 MOI的病毒相比1.0 MOI組H22細胞活力顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性,表明r Flu-mu CTLA-4能特異性殺傷H22細胞(P0.05)。在小鼠模型中能顯著抑制腫瘤體積,并延長小鼠的生存期。在血凝抑制實驗檢測到了較高的血凝抑制抗體效價,實驗結果表明重組溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4可以誘導小鼠產(chǎn)生保護性的抗體。結論:重組溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4在體內、外能靶向殺傷肝癌細胞,并能夠抑制小鼠腫瘤體積的增長,延長小鼠的生存期,并且給予病毒治療后小鼠的體內可以產(chǎn)生較高的保護性抗體,此研究有望為溶瘤病毒靶向治療肝癌提供新的思路。
【圖文】：

學碩士研究生學位論文（2019） 釋放到細胞或血液循環(huán)中的一類物質，病原體相關的分子模式是病原體上兩者均被模式識別受體識別引起免疫應答。溶瘤病毒又可促進樹突細胞浸瘤免疫應答的腫瘤相關抗原（tumor-associatedantigen，TAA）的交叉呈遞統(tǒng)性的抗腫瘤免疫反應[9]（Fig. 1）。大多數(shù)可用的溶瘤病毒均為經(jīng)過基靶向性較強，，并降低非腫瘤性宿主細胞的毒力[10]。因此，它們可以通過增別和隨后的免疫激活來刺激促炎環(huán)境，從而抵消惡性細胞的免疫逃避。還可利用腫瘤的致耐受性機制，促進病毒感染和殺死不受免疫系統(tǒng)保護的

點抑制劑毒療法雖然在治療腫瘤中潛力巨大，但其作為單一療法實現(xiàn)腫瘤的治因此，現(xiàn)在正在努力尋找可以進一步增強溶瘤病毒抗腫瘤功效的合理之一是通過免疫檢查點療法支持溶瘤病毒介導免疫原性細胞死亡。查點是指在免疫系統(tǒng)中存在的一些抑制性信號通路，細胞毒 T淋巴細otoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4）是 T淋巴細胞激活激因子。CTLA4 與抗原遞程細胞上的 B7結合，降低白介素-2及其受胞的細胞周期停滯于 Gl 期等，進而抑制 T淋巴細胞的增殖[34,7]。程序programmed death protein-1, PD-1）為Ⅰ型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋中的一員，是另一重要的免疫抑制受體，但是 PD-1的功能與 CTL，PD-1 主要調節(jié)組織和腫瘤內的效應 T 細胞活性，而不是在 T 細胞用[35]。免疫檢查點抑制劑 anti-CTLA-4 和 anti-PD-1 能夠釋放參與維細胞因子，而活化的 T 細胞可以破壞腫瘤細胞（Fig. 2）。
【學位授予單位】：內蒙古醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;Q78

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