【摘要】：1黃翅大白蟻品級(jí)分化機(jī)制研究社會(huì)性昆蟲白蟻存在明顯的品級(jí)分化現(xiàn)象,且不同種類白蟻的品級(jí)分化存在差異:高等白蟻的品級(jí)分化往往比低等白蟻更加復(fù)雜。目前對(duì)高等白蟻品級(jí)分化產(chǎn)生機(jī)制的研究仍相對(duì)較少。鑒于此,本文以一種品級(jí)系統(tǒng)十分復(fù)雜的高等白蟻——黃翅大白蟻Macrotermes barneyi Light為研究對(duì)象,開展了高等白蟻品級(jí)分化機(jī)制的研究。主要結(jié)果如下:(1)差異表達(dá)基因?qū)ζ芳?jí)分化的影響通過(guò)分析黃翅大白蟻5個(gè)未成熟品級(jí)(若蟻、大小先工蟻和大小先兵蟻)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),可知大先兵蟻(126個(gè)基因上調(diào),42個(gè)基因下調(diào))和若蟻(66個(gè)基因上調(diào),56個(gè)基因下調(diào))中差異表達(dá)基因數(shù)量最多,表明這兩個(gè)未成熟品級(jí)在巢群中的“特殊地位”。各個(gè)未成熟品級(jí)中均有許多差異表達(dá)基因與品級(jí)特異性表型相關(guān),例如品級(jí)分化、生殖(如Vtg基因)、能量代謝等相關(guān)基因在若蟻中顯著高表達(dá),免疫、抗氧化等相關(guān)基因在大先兵蟻中顯著高表達(dá),肌肉相關(guān)基因(如TnC基因)在大小先兵蟻中顯著高表達(dá),肌肉、表皮結(jié)構(gòu)等相關(guān)基因在大小先工蟻中顯著高表達(dá)。采用RNAi技術(shù)沉默若蟻的卵黃原蛋白基因Vitellogenin(Vtg)后,發(fā)現(xiàn)若蟻羽化時(shí)間提前,羽化率升高。沉默小先兵蟻肌鈣蛋白C基因Troponin C(TnC)后,發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)能力下降,體內(nèi)ATP含量升高;而沉默大先工蟻TnC基因后,發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)能力升高,體內(nèi)ATP含量下降;這表明TnC基因可能在黃翅大白蟻的小先兵蟻和大先工蟻中的功能有所不同,具有品級(jí)特異性。由此可見,差異表達(dá)基因可能是調(diào)控未成熟階段品級(jí)特異性表型發(fā)育的重要因素。(2)基因共表達(dá)對(duì)若蟻特異性表型的影響在分析5個(gè)未成熟品級(jí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,利用WGCNA法共鑒定到17個(gè)基因共表達(dá)模塊,其中Module 4中顯著聚集了若蟻的差異表達(dá)基因,包括與若蟻品級(jí)分化、生殖、能量代謝、免疫等表型相關(guān)的基因;在黃翅大白蟻的5個(gè)未成熟品級(jí)中只有若蟻可以發(fā)育為生殖品級(jí),因此將生殖表型與17個(gè)模塊進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)Modules 4與生殖表型關(guān)聯(lián)最密切。上述結(jié)果表明,聚類在Module 4中基因的共表達(dá)可能參與調(diào)控若蟻特異性表型,包括生殖、免疫和能量代謝等表型。(3)可變剪切對(duì)先兵蟻和先工蟻肌肉發(fā)育的影響通過(guò)可變剪切位點(diǎn)的鑒定和篩選發(fā)現(xiàn),先兵蟻(122個(gè)可變剪切位點(diǎn))和先工蟻(106個(gè)可變剪切位點(diǎn))特異性可變剪切位點(diǎn)數(shù)量均較多,而且大量發(fā)生可變剪切的基因與肌肉功能相關(guān)(先兵蟻:63個(gè)可變剪切位點(diǎn)位于22個(gè)基因;先工蟻:48個(gè)可變剪切位點(diǎn)位于10個(gè)基因)。通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),位于MHC、PDZ-LIM domain protein和Titin等3個(gè)肌肉發(fā)育基因的跳躍外顯子可變剪切轉(zhuǎn)錄本在先兵蟻中顯著低表達(dá),位于Tensin基因的5’端可變剪切轉(zhuǎn)錄本在先兵蟻和先工蟻中顯著低表達(dá)。若蟻特異性的可變剪切位點(diǎn)數(shù)量較少(33個(gè)可變剪切位點(diǎn)),而且發(fā)生可變剪切的基因與若蟻特異性表型無(wú)密切關(guān)系。由此可見,黃翅大白蟻先兵蟻和先工蟻的肌肉發(fā)育可能受到可變剪切的調(diào)控,而若蟻特異性表型較少受到可變剪切的調(diào)控。(4)保幼激素和5-羥色胺水平對(duì)品級(jí)分化的影響保幼激素III(juvenile hormone III,JH III)水平在若蟻中顯著更低,這有利于若蟻向有翅生殖蟻發(fā)育;JH III水平在先兵蟻中顯著更高,這有利于先兵蟻向兵蟻發(fā)育。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平在5個(gè)未成熟品級(jí)中存在顯著差異(先兵蟻先工蟻若蟻),這與5個(gè)未成熟品級(jí)的肌肉水平和在巢群中承擔(dān)的保衛(wèi)職能有密切關(guān)系。JH III和5-HT在5個(gè)未成熟品級(jí)之間的水平差異表明其可能在黃翅大白蟻的品級(jí)分化與發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。綜上所述,黃翅大白蟻的差異表達(dá)基因、基因共表達(dá)、可變剪切、保幼激素和5-羥色胺等指標(biāo)均存在品級(jí)特異性,在未成熟階段參與調(diào)控黃翅大白蟻的品級(jí)分化。2黑翅土白蟻巢友識(shí)別機(jī)制研究社會(huì)性昆蟲通過(guò)“識(shí)別線索”判斷對(duì)方是否為同巢個(gè)體的現(xiàn)象稱為巢友識(shí)別。目前對(duì)社會(huì)性昆蟲識(shí)別機(jī)制的研究主要針對(duì)異巢或天敵個(gè)體,而對(duì)白蟻同巢個(gè)體識(shí)別機(jī)制的研究較少,尤其是抗生素及與氣味識(shí)別和神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)相關(guān)的基因是否影響白蟻巢友識(shí)別尚不清楚。因此,本文選擇我國(guó)地下白蟻優(yōu)勢(shì)種——黑翅土白蟻Odontotermes formosanus Shiraki為研究對(duì)象,開展了高等白蟻巢友識(shí)別機(jī)制的研究。主要結(jié)果如下:(1)抗生素對(duì)黑翅土白蟻巢友識(shí)別的影響飼喂氨芐青霉素24 h后,處理組1(氨芐青霉素處理的1頭工蟻vs水處理的5頭工蟻)同巢工蟻間撕咬和后退行為持續(xù)時(shí)間顯著高于對(duì)照組(水處理的1頭工蟻vs水處理的5頭工蟻)。飼喂四環(huán)素24 h后,處理組1(四環(huán)素處理的1頭工蟻vs水處理的5頭工蟻)同巢工蟻間撕咬、抖動(dòng)、后退行為的持續(xù)時(shí)間均顯著或邊緣顯著高于處理組2(四環(huán)素處理的1頭工蟻vs四環(huán)素處理的5頭工蟻)和對(duì)照組�？梢�,氨芐青霉素和四環(huán)素可以干擾黑翅土白蟻巢友識(shí)別,誘導(dǎo)同巢工蟻間的威脅行為(抖動(dòng)和后退)和攻擊行為(撕咬)。(2)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選黑翅土白蟻巢友識(shí)別相關(guān)基因從黑翅土白蟻工蟻頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中,篩選嗅覺(jué)共同受體基因olfactory receptor co-receptor(Orco)和5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因5-HT transporter(5-HTT)為巢友識(shí)別相關(guān)候選基因,從116,885個(gè)Unigene中篩選出Orco的直系同源基因Unigene55916和5-HTT的直系同源基因Unigene 49370,開展后續(xù)的候選基因功能研究。(3)Orco基因?qū)诔嵬涟紫伋灿炎R(shí)別的影響Orco基因在黑翅土白蟻工蟻觸角中的表達(dá)水平顯著高于足、頭部和胸腹部。沉默Orco基因24 h后,白蟻體內(nèi)Orco基因表達(dá)水平顯著下降,處理組1(dsOrco處理的1頭目標(biāo)工蟻vs dsGFP處理的5頭非目標(biāo)工蟻)和處理組2(dsOrco處理的1頭目標(biāo)工蟻vs dsOrco處理的5頭非目標(biāo)工蟻)同巢工蟻間撕咬、抖動(dòng)和后退3種行為的持續(xù)時(shí)間均顯著高于對(duì)照組(dsGFP處理的1頭目標(biāo)工蟻vs dsGFP處理的5頭非目標(biāo)工蟻)�？梢�,Orco基因表達(dá)量下降會(huì)導(dǎo)致工蟻“氣味”感受能力下降,破壞巢友識(shí)別能力,導(dǎo)致巢友間攻擊行為(撕咬)和威脅行為(抖動(dòng)和后退)增加。(4)5-HTT基因?qū)诔嵬涟紫伋灿炎R(shí)別的影響5-HTT基因在黑翅土白蟻工蟻觸角中的表達(dá)水平顯著高于足、頭部和胸腹部。沉默5-HTT基因24 h后,白蟻體內(nèi)5-HTT基因表達(dá)水平顯著下降,處理組1(ds5-HTT處理的1頭目標(biāo)工蟻vs dsGFP處理的5頭非目標(biāo)工蟻)和處理組2(ds5-HTT處理的1頭目標(biāo)工蟻vs ds5-HTT處理的5頭非目標(biāo)工蟻)的同巢工蟻間撕咬、抖動(dòng)和后退3種行為的持續(xù)時(shí)間均顯著高于對(duì)照組(ds GFP處理的1頭目標(biāo)工蟻vs dsGFP處理的5頭非目標(biāo)工蟻)�？梢�,5-HTT基因表達(dá)量下降可能影響了工蟻神經(jīng)元對(duì)5-HT的重吸收,導(dǎo)致了巢友間攻擊行為(撕咬)或威脅行為(抖動(dòng)和后退)增加。綜上所述,抗生素(氨芐青霉素和四環(huán)素)、Orco和5-HTT基因表達(dá)量下降均可影響黑翅土白蟻的巢友識(shí)別,這為深入揭示高等白蟻的巢友識(shí)別機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

黃翅大白蟻品級(jí)分化機(jī)制研究技術(shù)路線圖

繪制黃翅大白蟻的生活史示意圖（圖 1.3）。經(jīng)鑒定后的未成熟品級(jí)蟲體置于 1.5 mL凍存管中，在液氮中速凍并于-80°C 保存?zhèn)溆�。收集巢體 1-5 的未成熟品級(jí)個(gè)體用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、qRT-PCR 驗(yàn)證、RT-PCR 驗(yàn)證、JH III 和神經(jīng)遞質(zhì) MRM 檢測(cè)等研究。本章使用的巢體 6-11 在 2018 年 3 月-5 月采集于湖北省武漢市、湖南省長(zhǎng)沙市、江西省吉安縣。從不同巢體中挑選若蟻、小先兵蟻、大先工蟻，，用于基因 Vtg 和 TnC的功能驗(yàn)證。巢體采集點(diǎn)信息及使用情況如表 1.1 所示。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q963

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2692283