【摘要】：目的:miR-34s作為抑癌基因已經(jīng)被廣泛研究和報(bào)道。這些研究主要是基于miRNA靶向抑制細(xì)胞周期、增殖、衰老、凋亡等過(guò)程中相關(guān)分子進(jìn)而產(chǎn)生的效應(yīng)。本研究是從上述事件的誘因考慮,主要探索miR-34s是否參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程、引起DNA損傷的分子機(jī)制以及對(duì)DNA損傷的效應(yīng)事件,例如:周期阻滯、增殖抑制以及細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響。方法:(1)用miR-34s或陰性對(duì)照miR-NC模擬物分別轉(zhuǎn)染HCT116、HT29、U2OS細(xì)胞,利用western blot檢測(cè)DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)標(biāo)志物γH2AX蛋白水平。然后給予HCT116細(xì)胞相同的處理,利用免疫熒光法檢測(cè)γH2AX焦點(diǎn)(foci)以及彗星電泳法檢測(cè)尾部DNA百分比。(2)用miR-34s或miR-NC模擬物轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布(n=3)。(3)用miR-34s或miR-NC模擬物轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),利用CCK-8法(n=5)和克隆形成實(shí)驗(yàn)(n=3)檢測(cè)細(xì)胞增殖與存活。(4)用miR-34s或miR-NC模擬物轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,利用Annexin V-FITC/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分比(n=3)。(5)用miR-34c-5p或miR-NC模擬物轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)檢測(cè)miR-34c-5p表達(dá)水平,利用western blot對(duì)HR和NHEJ修復(fù)相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。(6)DR-GFP/I-SceI HR修復(fù)報(bào)告質(zhì)粒與miR-34a/b/c-5p或miR-NC模擬物共轉(zhuǎn)HCT116細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP~+細(xì)胞百分比(n=3)。(7)miR-34a/b/c-5p或miR-NC模擬物與RAD51過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-MYC-RAD51或陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-MYC共轉(zhuǎn)染,利用western blot檢測(cè)RAD51和γH2AX蛋白表達(dá)水平。(8)利用qPCR檢測(cè)miR-34a/b/c-5p過(guò)表達(dá)后RAD51 mRNA表達(dá)水平。利用生物信息學(xué)分析miR-34s與RAD51mRNA潛在的結(jié)合位點(diǎn),并利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證(n=3)。(9)用miR-34a/b/c-5p或miR-NC模擬物分別轉(zhuǎn)染HCT116 p53~(wt)和HCT116 p53~(-/-)細(xì)胞,利用western blot檢測(cè)p53、RAD51和γH2AX的蛋白水平以及利用qPCR檢測(cè)p53和RAD51的mRNA水平。結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染后48 h,在HCT116、HT29和U2OS細(xì)胞中miR-34s組的γH2AX蛋白水平不同程度地上調(diào),但這三種細(xì)胞的結(jié)果不完全一致。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)和彗星電泳實(shí)驗(yàn)中,miR-34s家族除了miR-34b-3p,其它家族成員均能明顯增加γH2AX焦點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(γH2AX焦點(diǎn)5)以及尾部DNA百分比。(2)于轉(zhuǎn)染后48 h和72 h,miR-34s家族除了miR-34b-3p和miR-34c-3p,其它家族成員均能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯并伴隨著S期以及G2/M期細(xì)胞比例降低。(3)上調(diào)HCT116細(xì)胞中miR-34s水平后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變,表現(xiàn)為:細(xì)胞由長(zhǎng)梭形或多角形變?yōu)閳A形或橢圓形,細(xì)胞表面變得粗糙,細(xì)胞之間黏連增多以及細(xì)胞密度明顯減少。轉(zhuǎn)染后24 h,在倒置顯微鏡下已經(jīng)可以觀察到組間差異,在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h,組間差異較為顯著。細(xì)胞增殖檢測(cè)以及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示細(xì)胞增殖與存活能力明顯受到抑制。上述結(jié)果中miR-34b-3p作用均較弱。(4)上調(diào)HCT116細(xì)胞中miR-34s水平,miR-34s組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡。于轉(zhuǎn)染后48 h,除了miR-34a-3p和miR-34b-3p組,其它實(shí)驗(yàn)組凋亡水平均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在轉(zhuǎn)染后72 h,各實(shí)驗(yàn)組均可不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中miR-34a-3p和miR-34b-3p誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力較弱。(5)利用miR-34c-5p和miR-NC模擬物轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,于轉(zhuǎn)染后24 h和48 h,與miR-NC組相比miR-34c-5p組中miR-34c-5p表達(dá)水平上調(diào)約20倍,此外RAD51和PLK1蛋白水平均明顯下調(diào),其它HR修復(fù)和NHEJ修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)水平也發(fā)生一定程度的變化,例如RAD50和DNA-PKcs Ser~(2056)蛋白表達(dá)水平增加,以及BCL2和LIG4蛋白表達(dá)水平降低。(6)過(guò)表達(dá)miR-34a/b/c-5p或轉(zhuǎn)染si-RAD51均可明顯抑制RAD51蛋白表達(dá)水平和GFP~+細(xì)胞百分比。GFP~+細(xì)胞百分比代表HR修復(fù)效率。(7)過(guò)表達(dá)RAD51可部分逆轉(zhuǎn)miR-34a/b/c-5p誘導(dǎo)的高水平γH2AX。(8)qPCR結(jié)果顯示miR-34a/b/c-5p可在mRNA水平抑制RAD51。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示miR-34a/b/c-5p可分別靶向結(jié)合RAD51mRNA 3’UTR序列的137-158 nt、137-159 nt以及136-158 nt位點(diǎn)。(9)miR-34a/b/c-5p能夠上調(diào)p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平。在HCT116 p53~(wt)細(xì)胞中,miR-34a/b/c-5p對(duì)RAD51的抑制作用要明顯強(qiáng)于在HCT116 p53~(-/-)細(xì)胞中miR-34a/b/c-5p對(duì)RAD51的抑制作用,而且在HCT116 p53~(wt)細(xì)胞中γH2AX蛋白水平要明顯高于HCT116 p53~(-/-)細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)水平。討論:(1)miR-34家族均可不同程度地誘導(dǎo)DSBs發(fā)生,且具有細(xì)胞特異性,在HCT116細(xì)胞中miR-34b-3p的作用較弱。(2)miR-34s家族可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不同程度的G1期阻滯,增殖抑制以及凋亡,這些結(jié)果與DSBs表型基本符合,表明miR-34s通過(guò)誘發(fā)DSBs進(jìn)而引起G1期阻滯、抑制增殖和促進(jìn)凋亡。(3)我們發(fā)現(xiàn)miR-34a/b/c-5p可在mRNA水平和蛋白水平抑制RAD51的表達(dá)。DR-GFP/I-SceI HR修復(fù)報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示miR-34a/b/c-5p和si-RAD51均能夠明顯抑制HR修復(fù)效率,過(guò)表達(dá)RAD51可部分逆轉(zhuǎn)miR-34a/b/c-5p引起的DSBs表型。這些結(jié)果充分證實(shí)了miR-34a/b/c-5p是通過(guò)抑制RAD51引起HR修復(fù)活性減弱進(jìn)而引起DSBs發(fā)生。(4)miR-34a/b/c-5p對(duì)RAD51的抑制作用不僅存在直接抑制,也存在間接調(diào)控。我們利用HCT116 p53~(wt)和HCT116 p53~(-/-)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)p53參與了miR-34a/b/c-5p對(duì)RAD51的抑制作用。
【圖文】：

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文程中需要施加凋亡誘導(dǎo)劑，以便于調(diào)整補(bǔ)償。1.2 結(jié)果miR-34s 不同程度上調(diào) γH2AX 蛋白表達(dá)水平在 DSBs 形成后，染色質(zhì)中組蛋白 H2AX 的 SQE 結(jié)構(gòu)域中 Ser139 殘基迅酸化形成 γH2AX。γH2AX 作為 DNA 損傷標(biāo)志物已經(jīng)被廣泛證實(shí)，本研在多種細(xì)胞中（HCT116、HT29、U2OS 細(xì)胞）分別轉(zhuǎn)染 miR-34s 和陰性miR-NC 模擬物，于轉(zhuǎn)染后 48 h 收集細(xì)胞進(jìn)行 western blot 檢測(cè) γH2AX 蛋水平，，進(jìn)而分析 miR-34s 能否誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) DNA 損傷產(chǎn)生。研究結(jié)果顯示：4s 家族每個(gè)成員均可不同程度上調(diào)細(xì)胞內(nèi) γH2AX 蛋白表達(dá)水平，而且在胞類(lèi)型中，該作用結(jié)果不完全一致，表明 miR-34s 家族每一個(gè)成員均可不誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) DNA 損傷，但其作用具有細(xì)胞特異性（圖 1-1）。

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文可接觸性，導(dǎo)致特異性 DNA 損傷修復(fù)蛋白被招募和聚集至 DNA 斷裂位點(diǎn)并形成焦點(diǎn)[11,12]�；诿庖邿晒夥軌蚯逦乜吹郊�(xì)胞核內(nèi)散在的 γH2AX 焦點(diǎn)，此方法已經(jīng)成為一種非常靈敏可靠的檢測(cè) DSBs 的方法。圖 1-1 結(jié)果提示過(guò)表達(dá)miR-34s 可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生 DSBs，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們?cè)?HCT116 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-34s 和陰性對(duì)照 miR-NC 模擬物，于轉(zhuǎn)染后 48 h 終止細(xì)胞培養(yǎng)并利用間接免疫熒光法分析 miR-34s 家族對(duì) γH2AX foci 形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染后 48h，除了 miR-34b-3p，其它家族成員均能明顯增加細(xì)胞內(nèi) γH2AX 焦點(diǎn)（圖 1-2），該結(jié)果與圖 1-1 中 miR-34s 家族對(duì) HCT116 細(xì)胞作用結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了 miR-34s 可不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) DSBs 發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q75

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 岑夫子;;制造前所未有的生命[J];風(fēng)流一代;2019年23期

2 劉濤;;關(guān)于幾種植物材料DNA含量差異性的研究[J];中學(xué)生物學(xué);2019年03期

3 陳從周;;DNA折紙術(shù)——全編程的信息工具[J];廣州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2019年01期

4 Jiaojiao Zhang;Feng Li;Dayong Yang;;DNA: From Carrier of Genetic Information to Polymeric Materials[J];Transactions of Tianjin University;2019年04期

5 李文送;;DNA甲基化及其生物學(xué)功能[J];生物學(xué)教學(xué);2014年09期

6 劉慶華;茹慧香;;“DNA是主要的遺傳物質(zhì)”教學(xué)設(shè)計(jì)[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年07期

7 丁思思;袁華;羅小虎;李高峰;;植物DNA粗提取與鑒定的簡(jiǎn)便方法[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年19期

8 周苑;;《DNA分子的結(jié)構(gòu)》微課程設(shè)計(jì)[J];中國(guó)信息技術(shù)教育;2016年24期

9 吳久宏;;追尋人類(lèi)思維的脈絡(luò)——蘇教版“DNA分子的結(jié)構(gòu)”一節(jié)科學(xué)史料教學(xué)設(shè)計(jì)[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年21期

10 唐琳;;《DNA是主要的遺傳物質(zhì)》教學(xué)設(shè)計(jì)(第一課時(shí))[J];課程教育研究;2016年35期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉冰;王旭;趙夢(mèng)真;晁潔;樊春海;;基于DNA折紙術(shù)的納米金棒精密修飾[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第二十八分會(huì)：化學(xué)生物學(xué)[C];2016年

2 劉冬生;李闖;程恩雋;邢永政;金娟;;DNA超分子水凝膠及其應(yīng)用[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第二十四分會(huì)：超分子組裝與軟物質(zhì)材料[C];2016年

3 Kaiying Cheng;Hong Xu;Xuanyi Chen;Liangyan Wang;Bing Tian;Ye Zhao;Yuejin Hua;;Structural basis for DNA 5′-end resection by RecJ[A];第五屆中國(guó)結(jié)構(gòu)生物學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)摘要集[C];2016年

4 陳南迪;覃詩(shī)雅;羊小海;王青;翦立新;王柯敏;;“傳感-治療”的DNA納米裝置在協(xié)同殺傷循環(huán)腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第三十八分會(huì)：納米生物效應(yīng)與納米藥物化學(xué)[C];2016年

5 劉曄華;陳錦艷;江雁;張堅(jiān)磊;穆紅;;磁珠法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA的評(píng)價(jià)[A];第七屆中國(guó)臨床微生物學(xué)大會(huì)暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2016年

6 譚磊;孫悅;周湘;劉偉;;多頭蚴核糖體DNA及線粒體DNA多態(tài)性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

7 葉俏;沈潔;嚴(yán)婷婷;王宙政;;原發(fā)性干燥綜合征患者血漿循環(huán)DNA與疾病活動(dòng)相關(guān)性研究[A];2015年浙江省風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2015年

8 周嘉嘉;FriederikeSchmid;;計(jì)算模擬研究DNA和聚電解質(zhì)的結(jié)合[A];2015年全國(guó)高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集——主題E 高分子理論計(jì)算模擬[C];2015年

9 Yuan Zhang;Yanlong Chen;Gaigai Xu;Chen Lan;Shaige Xia;Wenjie Zhao;Shusheng Zhang;;Endogenous DNA adducts method establishment and Human Biomonitoring[A];河南省化學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2016年

10 孫覓;辛麗斐;劉宏;;基于濃差電池原理高靈敏檢測(cè)DNA的傳感器[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第四分會(huì)：生物分析和生物傳感[C];2016年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 黃辛;DNA骨架硫修飾研究又獲新成果[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2011年

2 本報(bào)記者 辛明;鄧亞軍：災(zāi)難現(xiàn)場(chǎng)的DNA斗士[N];中國(guó)青年報(bào);2011年

3 本報(bào)記者 歐陽(yáng)曉紅　韓宋輝;“可怕”的友邦DNA 267億港元凈利從何而來(lái)[N];經(jīng)濟(jì)觀察報(bào);2015年

4 深圳特區(qū)報(bào)首席記者 孫錦;解讀DNA惠及世界患癌兒童[N];深圳特區(qū)報(bào);2018年

5 記者 馮衛(wèi)東;DNA分子計(jì)算為可編程藥丸鋪路[N];科技日?qǐng)?bào);2018年

6 本報(bào)記者 李禾;DNA折紙術(shù)，“折”出生命所需神奇圖案[N];科技日?qǐng)?bào);2019年

7 記者 劉霞;美日創(chuàng)建迄今最大DNA基因模型[N];科技日?qǐng)?bào);2019年

8 任芳言;古DNA揭示馬的身世[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

9 記者 馮衛(wèi)東;基因剪刀剪切DNA過(guò)程首次捕獲[N];科技日?qǐng)?bào);2019年

10 中國(guó)科學(xué)院院士 華大基因理事長(zhǎng) 楊煥明;聽(tīng)DNA說(shuō)前世今生[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李佳倫;USP7負(fù)調(diào)控DNA甲基化的機(jī)制和功能研究[D];華東師范大學(xué);2017年

2 薛仁余;組氨酸磷酸激酶NME1在DNA損傷修復(fù)中的功能研究[D];軍事科學(xué)院;2019年

3 王琳;鐮孢菌DNA條形碼及多樣性研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 王倩倩;雙加氧酶Tet對(duì)DNA甲基化修飾的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 王丹;DNA損傷應(yīng)答中長(zhǎng)非編碼RNA LRIK、ncRNA0301及蛋白質(zhì)XPF的功能研究[D];湖南大學(xué);2018年

6 田茜;黃單胞菌屬DNA條形碼篩選及其重要致病變種檢測(cè)技術(shù)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

7 吳成超;序列復(fù)雜度方法在DNA調(diào)控元件預(yù)測(cè)中的應(yīng)用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

8 吳丹;CRISPR/C2c1的結(jié)構(gòu)與功能機(jī)制研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2017年

9 王泉博;基于卟啉及二維納米材料的DNA檢測(cè)新方法研究[D];南京大學(xué);2015年

10 任克維;基于DNA組裝的電化學(xué)免疫分析及siRNA特異性運(yùn)載[D];南京大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 聶永強(qiáng);位點(diǎn)特異整合微環(huán)DNA的體內(nèi)制備及優(yōu)化[D];上海交通大學(xué);2017年

2 王清曼;從單分子水平研究人類(lèi)RPA蛋白對(duì)單鏈DNA結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

3 杜婷;基于主客體作用的DNA-傒酰亞胺衍生物組裝體的形貌調(diào)控研究[D];武漢科技大學(xué);2019年

4 曲藝姣;DNA樹(shù)枝狀大分子納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行腫瘤免疫治療的研究[D];上海交通大學(xué);2017年

5 陳曦;基于力示蹤技術(shù)對(duì)單個(gè)DNA四面體跨膜動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

6 張遠(yuǎn)航;DNA糖苷酶OGG1的修復(fù)活性對(duì)基因表達(dá)的影響[D];東北師范大學(xué);2019年

7 龔念;西南地區(qū)短翅蠟蟬科分類(lèi)及DNA條形碼研究[D];貴州大學(xué);2019年

8 姚克喜;采用DNA條形碼技術(shù)鑒定寧鄉(xiāng)豬個(gè)體身份的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

9 段秋月;利用DNA同源重組工程和CRISPR/Cas9構(gòu)建SCN9A人源化小鼠[D];山東大學(xué);2019年

10 羅小夢(mèng);DNA醛基修飾的選擇性熒光標(biāo)記研究[D];武漢大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2688173