【摘要】：體細胞誘導為多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)包含眾多的細胞生理狀態(tài)變化,包括核質(zhì)比增加、線粒體減少和自噬改變等。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),自噬與兔體細胞重編程為誘導多能干細胞(RiPSCs)的過程密切相關(guān),但其作用機理尚不清楚。因此,本試驗通過探究RiPSCs誘導過程中細胞自噬和能量代謝的相關(guān)變化;在此基礎(chǔ)上,研究雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)促進細胞自噬對RiPSCs誘導過程的影響。為解析細胞自噬在重編程過程中的作用和豐富重編程機理奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1兔iPSCs誘導過程中自噬的變化:通過四環(huán)素(Dox)誘導型慢病毒載體將OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4(OSKM)導入兔成纖維細胞(REF)中,觀察重編程過程中細胞形態(tài)變化,并對獲得的RiPSCs進行免疫熒光及RT-PCR的多能性分析;;接著采用RT-PCR和透射電子顯微鏡的方法對重編程過程中細胞自噬的相關(guān)變化情況進行分析。結(jié)果顯示,在重編程過程中,細胞變小、細胞核變大、細胞邊緣折光性強、發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變的細胞能夠與未轉(zhuǎn)變的細胞明顯區(qū)別開來,并形成細胞集落。免疫熒光結(jié)果表明,RiPSCs克隆表達OCT4、SSEA4,NANOG。在重編程過程中,多能性基因C-MYC、KLF4、SOX2、OCT4的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;自噬相關(guān)基因的表達量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。透射電鏡結(jié)果顯示,自噬體樣結(jié)構(gòu)在重編程過程中也是呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢。以上結(jié)果說明,RiPSCs誘導過程中多能基因的表達和自噬水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。2兔iPSCs誘導過程的代謝變化:本試驗采用Mitotracker線粒體特異性標記及RT-PCR對代謝相關(guān)基因的mRNA相對表達量進行檢測;同時,使用細胞能量代謝儀(Seahorsse XF24 Extracellular Analyzer,XF)對重編程過程中的細胞進行線粒體呼吸和糖酵解功能檢測,進一步細胞能量代謝表型進行分析,評估細胞所處的代謝類型。結(jié)果顯示,重編程過程中線粒體形態(tài)由長桿狀變成小點狀,數(shù)量迅速減少。線粒體發(fā)生相關(guān)基因NRF1、PCG1αα的表達量在重編程過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;TFAM、Rad51的表達量在重編程過程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。糖酵解相關(guān)基因PFK、HK2在RiPSCs中的表達量達到最高,PK在RiPSCs中表達量達到最低。XF試驗結(jié)果顯示,REF、誘導5d細胞、RiPSCs代謝能力逐漸增強;其中REF代謝相對較弱,偏向于靜息狀態(tài);RiPSCs代謝旺盛,屬于高能量需求類型的細胞,更容易發(fā)生糖酵解。以上結(jié)果說明,重編程過程中細胞線粒體形態(tài)由長桿狀轉(zhuǎn)變成小點狀且數(shù)量迅速減少;REF代謝能力相對較弱,偏向靜息狀態(tài);RiPSCs代謝旺盛,更傾向于發(fā)生糖酵解。3促進自噬對RiPSCs誘導過程的影響:在前面試驗研究基礎(chǔ)上,添加Rapa促進細胞自噬,探討調(diào)控自噬對RiPSCs誘導效率、重編程過程中多能性相關(guān)基因、自噬相關(guān)基因的表達以及細胞代謝的影響。結(jié)果顯示,添加0.5nM Rapa處理,促進自噬顯著提高堿性磷酸酶陽性克隆數(shù)和多能性基因C-MYC、OCT4在RiPSCs中的表達量;重編程過程中自噬相關(guān)基因表達水平升高,細胞自噬體樣結(jié)構(gòu)增加。XF結(jié)果顯示,Rapa抑制了重編程過程中細胞線粒體呼吸代謝、降低了糖酵解功能的細胞代謝。以上結(jié)果表明,促進自噬降低了細胞的生物能量,提高了重編程效率,但同時也減弱了細胞對外界的應(yīng)激抵抗能力。以上結(jié)果表明,在RiPSCs誘導過程中,細胞自噬水平呈現(xiàn)先升高后降低,細胞代謝能力逐漸增強;添加雷帕霉素,促進細胞自噬水平,可以通過降低細胞的生物能量,從而提高重編程效率,但同時也減弱了細胞對外界的應(yīng)激抵抗能力。
【圖文】：

并換成含Ｄｏｘ的２０Ｋ誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每天換液一次，，同時活細胞工作逡逑站下觀察細胞形態(tài)變化并拍照記錄。根據(jù)細胞形變等數(shù)據(jù)得到ＲｉＰＳＣｓ誘導的周期，如逡逑圖１－１所示。逡逑將加入Ｄｏｘ后的誘導培養(yǎng)時間計為０天，根據(jù)誘導過程中，細胞的形態(tài)記錄可知，逡逑在誘導的第２天少量細胞開始發(fā)生形態(tài)變化，細胞變�。徽T導的第３天形變的細胞邊緣逡逑折光性強，細胞核變大，能夠與未形變細胞明顯區(qū)別開來；誘導第４天，細胞^u始聚集；逡逑誘導第５天形變的細胞聚成集落，第６天集落中的細胞排列緊密；誘導第８天，形成的逡逑克隆中間開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，提示可以進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)記錄得出兔成纖維細胞誘導逡逑過程中細胞的形態(tài)變化如圖１－２所示。逡逑傳代并換成逡逑ＫＳＲ誘導液逡逑病毒：逡逑感個染邐ＭＥＴ過程細邐個ＲｉＰＳＣｓ－ｌｉｋｅ邐個逡逑胞逐漸形變邐克隆形成邋＞邋挑取兗隆逡逑－２ｄ邐Ｏｄ邐５ｄ邐８ｄ邐ｌ0ｄ逡逑圖１－１邋ＯＳＫＭ慢病毒體系下兔ｉＰＳＣｓ的誘導周期逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｒａｂｂｉｔ邋ｉＰＳＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋４Ｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑２３逡逑

并換成含Ｄｏｘ的２０Ｋ誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每天換液一次，同時活細胞工作逡逑站下觀察細胞形態(tài)變化并拍照記錄。根據(jù)細胞形變等數(shù)據(jù)得到ＲｉＰＳＣｓ誘導的周期，如逡逑圖１－１所示。逡逑將加入Ｄｏｘ后的誘導培養(yǎng)時間計為０天，根據(jù)誘導過程中，細胞的形態(tài)記錄可知，逡逑在誘導的第２天少量細胞開始發(fā)生形態(tài)變化，細胞變�。徽T導的第３天形變的細胞邊緣逡逑折光性強，細胞核變大，能夠與未形變細胞明顯區(qū)別開來；誘導第４天，細胞^u始聚集；逡逑誘導第５天形變的細胞聚成集落，第６天集落中的細胞排列緊密；誘導第８天，形成的逡逑克隆中間開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，提示可以進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)記錄得出兔成纖維細胞誘導逡逑過程中細胞的形態(tài)變化如圖１－２所示。逡逑傳代并換成逡逑ＫＳＲ誘導液逡逑病毒：逡逑感個染邐ＭＥＴ過程細邐個ＲｉＰＳＣｓ－ｌｉｋｅ邐個逡逑胞逐漸形變邐克隆形成邋＞邋挑取兗隆逡逑－２ｄ邐Ｏｄ邐５ｄ邐８ｄ邐ｌ0ｄ逡逑圖１－１邋ＯＳＫＭ慢病毒體系下兔ｉＰＳＣｓ的誘導周期逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｒａｂｂｉｔ邋ｉＰＳＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋４Ｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑２３逡逑
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q813

【參考文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 李媛;自噬對重編程的影響及機制研究[D];中國科學技術(shù)大學;2013年

本文編號：2678224