【摘要】：感受體內外溫度變化是生物與生俱來的能力,可有效的調節(jié)和保持體溫。溫度敏感TRP(Transient receptor potential,TRP)通道為主要的細胞溫度感受器,但有關人類和哺乳動物溫度敏感行為的分子細胞整合機制仍不甚清楚。本論文探究出生后早期大鼠和小鼠冷敏響應的發(fā)育關鍵期,確定出生后早期大鼠和小鼠冷敏行為與TRPA1通道表達的相關性,篩查TRPA1通道與冷敏響應發(fā)育相關的內源性表達調控機制,以期豐富靶向研究TRPA1通道溫敏的調控機制。因此本論文檢測出生后1天(D)-6周(W)大鼠和TRPA1~(-/-)與TRPA1~(+/+)(WT)小鼠冷敏行為、qRT-PCR檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)冷敏TRP通道m(xù)RNA、膜片鉗記錄大鼠DRG TRPA1通道電流以及Tenascins對轉染mTRPA1通道電流的影響。主要結果如下:1.大鼠冷敏行為發(fā)育變化(1)3W-4W大鼠的體重增加最快,是大鼠體重發(fā)育關鍵期。(2)9℃和13℃大鼠冷刺激縮足閾值都在3W潛伏期最短,并在4W出現(xiàn)快速上升,是大鼠冷敏行為發(fā)育關鍵時期。大鼠冷敏行為隨著周齡呈規(guī)律變化,具有周齡依賴性,且刺激溫度越低,大鼠反應越敏感。2.大鼠DRG冷敏TRP通道m(xù)RNA表達的發(fā)育變化各周齡TRPC5 mRNA表達量較1D齡大鼠均顯著下調。TRPM8 mRNA表達量在1W-3W顯著上調,4W-6W顯著下調。TRPA1 mRNA 2W-6W表達顯著上調,4W相對3W快速下降。大鼠DRG細胞冷敏TRP通道(TRPC5、TRPM8、TRPA1)mRNA表達具有周齡依賴性并且3W-4W可能是TRPA1和TRPM8 mRNA表達發(fā)育關鍵期。3.大鼠DRG TRPA1通道電流的發(fā)育變化采用電生理膜片鉗記錄出生后3D-6W大鼠DRG TRPA1通道電流變化,結果顯示,隨周齡增加,TRPA1電流從3D-4W除3W外逐漸增加,5W-6W電流逐漸減小,其中2W-4W顯著增大。表明TRPA1電流存在周齡依賴性,且3W-4W TRPA1電流快速上升,可能為TRPA1電流發(fā)育的關鍵期。4.TRPA1~(-/-)與TRPA1~(+/+)小鼠體重發(fā)育變化(1)3W-4W兩種小鼠的體重增加最快,是體重發(fā)育關鍵期。(2)1D-4W TRPA1~(-/-)小鼠體重均高于TRPA1~(+/+)小鼠,說明TRPA1基因敲除可能增加1D-4W小鼠體重。(3)連續(xù)13℃刺激時,TRPA1~(-/-)小鼠體重顯著增加期延遲至2W,說明13℃刺激可能延緩TRPA1~(-/-)小鼠體重發(fā)育,連續(xù)17℃刺激無影響。(4)連續(xù)13℃和17℃刺激下TRPA1~(+/+)小鼠體重顯著增加期提前至1W,說明13℃和17℃刺激可能加速了TRPA1~(+/+)小鼠體重發(fā)育。(5)連續(xù)13℃刺激降低TRPA1~(-/-)小鼠(無顯著性差異)而增加TRPA1~(+/+)小鼠體重大小,并在4W時顯著增加。提示連續(xù)13℃刺激增加小鼠體重且可能與TRPA1基因有關。5.TRPA1~(-/-)與TRPA1~(+/+)小鼠冷敏行為發(fā)育變化(1)TRPA1~(-/-)小鼠單次13℃冷刺激時,冷刺激縮足閾值在4W出現(xiàn)快速上升并具顯著差異,說明3W-4W可能是TRPA1~(-/-)小鼠冷敏行為發(fā)育關鍵期。出生后早期TRPA1~(+/+)小鼠冷敏行為均有顯著性差異。(2)出生后早期TRPA1~(-/-)小鼠1W-6W基本較TRPA1~(+/+)小鼠冷敏行為減弱,并且在4W時有顯著性差異,說明TRPA1基因缺失可能影響小鼠對低溫變化的正常感知。(3)連續(xù)13℃刺激時較單次13℃刺激,TRPA1~(-/-)小鼠冷敏行為相對不敏感期提前到3W且延長到5W,TRPA1~(+/+)小鼠3W-6W溫度響應變得不敏感。結果提示連續(xù)低溫刺激延緩了小鼠對溫度的感知的發(fā)育,并且這種影響可能與TRPA1基因有關。6.胞外基質對mTRPA1通道電流的作用(1)在0.1μg、0.2μg和0.4μg胞外基質Tenascin-C存在時:mTRPA1通道電壓誘發(fā)的電流減小,激活延緩,0.1μg降低效果最明顯。mTRPA1通道配體誘發(fā)電流減小,0.4μg時顯著性降低。(2)在2.5μg胞外基質Tenascin-R存在時:mTRPA1通道電壓誘發(fā)的電流增大,易化激活,而配體誘發(fā)的電流減小。綜上,大鼠冷敏行為、DRG上TRPA1 mRNA和TRPA1通道電流發(fā)育具有周齡依賴性,并都在3W-4W發(fā)生快速改變,說明3W-4W可能為大鼠TRPA1通道表達發(fā)育關鍵期。通過大鼠實驗結果初步確定了TRPA1通道發(fā)育關鍵期后進一步利用敲除小鼠探究冷敏行為與TRPA1通道的關系。小鼠行為學結果提示連續(xù)溫度刺激和TRPA1基因可能影響小鼠冷敏行為和體重發(fā)育。Tenascin-C和Tenascin-R對mTRPA1通道電流有不同的影響,對不同誘發(fā)方式誘發(fā)出的電流的影響也不同。由于時間關系有關Tenascins與TRPA1介導的冷敏發(fā)育的分子與細胞整合機制有待后續(xù)工作闡明。
【圖文】：

圖 1-1 哺乳動物 TRP 離子通道家族系統(tǒng)樹以及 TRP 通道蛋白亞基的組織拓撲. 1-1 Mammalian TRP ion channel family phylogenetic tree and tissue topology map channel protein subunits[37]TRP 通道主要以同源或異源四聚體形式在信號轉導中發(fā)揮作用（圖 1-的研究表明：TRPV1 通道通過 TRPV1 亞基 C 末端區(qū)域的 21 個氨基酸四聚體通道。作為一種多功能細胞感受器，TRP 通道主要存在于感覺神痛覺、溫覺、機械感覺等眾多生理過程。在炎癥和神經(jīng)受損期間，TR變化、機械刺激等更加敏感，因此被認為是治療人類炎癥性和神經(jīng)性疼物靶點[38]。

哺乳動物 TRP 離子通道家族系統(tǒng)樹以及 TRP 通道蛋白亞基的組織mmalian TRP ion channel family phylogenetic tree and tissue topologychannel protein subunits[37]道主要以同源或異源四聚體形式在信號轉導中發(fā)揮作用（表明：TRPV1 通道通過 TRPV1 亞基 C 末端區(qū)域的 21 個氨道。作為一種多功能細胞感受器，TRP 通道主要存在于感覺、機械感覺等眾多生理過程。在炎癥和神經(jīng)受損期間，械刺激等更加敏感，因此被認為是治療人類炎癥性和神經(jīng)8]。
【學位授予單位】：延安大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q25

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本文編號：2674214