【摘要】：小桐子是一種具有巨大開發(fā)潛力的能源植物樹種,低溫是影響小桐子存活和生長的主要限制因子。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究表明低溫鍛煉顯著提高小桐子的抗冷性。已知miRNAs在植物對逆境脅迫響應(yīng)與適應(yīng)中起重要作用,但miRNAs如何調(diào)控小桐子抗冷性尚未見到報道。弄清小桐子低溫鍛煉過程中miRNAs參與抗冷性提高的分子機(jī)制,獲取與抗冷性密切相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs及其靶基因,有助于我們更好理解小桐子抗冷性形成的分子機(jī)制。本研究首先進(jìn)行了小桐子低溫脅迫下microRNAs實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參的篩選與比較,而后分析了低溫鍛煉誘導(dǎo)小桐子抗冷性形成過程中一些重要的miRNAs基因及其對應(yīng)的靶基因表達(dá)的變化,為揭示miRNAs參與小桐子低溫鍛煉下抗冷性形成的分子機(jī)制提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.基于以前的小RNA-seq結(jié)果,以低溫處理的小桐子為材料,挑選11個候選內(nèi)參基因,用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測它們在不同樣本中的表達(dá)量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性綜合分析。結(jié)果表明,表達(dá)最穩(wěn)定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值為23左右,表達(dá)豐度適中;U6的Ct值為10左右,表達(dá)豐度高;因此,miR6448可作為小桐子低溫脅迫下表達(dá)豐度適中的miRNAs qRT-PCR的內(nèi)參基因;U6可作為小桐子低溫脅迫下豐度較高的miRNAs qRT-PCR的內(nèi)參基因。2.通過熒光定量PCR檢測小桐子低溫脅迫下的32個差異表達(dá)的候選miRNAs,發(fā)現(xiàn)除miR5284、miR5494、miR6189外,其它miRNAs的表達(dá)趨勢與小RNA-seq的結(jié)果一致;檢測結(jié)果表明:在低溫脅迫處理期間經(jīng)過鍛煉小桐子幼苗中22個miRNAs的表達(dá)量高于未經(jīng)過鍛煉的;經(jīng)過鍛煉的小桐子幼苗中8個miRNAs的表達(dá)量低于未經(jīng)過鍛煉的;2個miRNAs的表達(dá)量在經(jīng)過鍛煉與未經(jīng)鍛煉的小桐子幼苗中無顯著性差異。qRT-PCR的結(jié)果為低溫鍛煉誘導(dǎo)小桐子抗冷性形成過程中一些重要的miRNA的進(jìn)一步研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.通過對32個有差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行的生物信息學(xué)分析,對其靶基因預(yù)測進(jìn)行了GO富集、KEGG富集和功能歸類。GO富集分析,參與脂質(zhì)代謝過程的靶基因有10個,有84個基因參與蛋白質(zhì)去磷酸化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過程等生物學(xué)過程;KEGG富集共獲得212條pathway通路,參與植物激素信號傳導(dǎo)的靶基因有12個,參與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的靶基因有12個,參與脂肪酸代謝的靶基因有9個,參與磷脂酶的有5個靶基因;對預(yù)測到的靶基因進(jìn)行功能歸類,大致分為:轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、磷酸酶、合酶、合成酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、還原酶、水解酶、磷脂酶、脫飽和酶。采用熒光定量PCR對小桐子低溫脅迫下6個候選miRNA及其響應(yīng)的與膜脂密切相關(guān)的靶基因,進(jìn)行miRNA-mRNA表達(dá)模式分析,結(jié)果表明:miR5254對靶基因PLC起到負(fù)調(diào)控作用;miR5284對靶基因FAD6起到負(fù)調(diào)控作用;miR6189對靶基因FAR起到正調(diào)控作用;miR165、miR4239對靶基因PLA起到負(fù)調(diào)控作用;miR5827對靶基因FAD3起到負(fù)調(diào)控作用。4.從鑒定到的6個與低溫脅迫下受miRNA調(diào)控的與膜脂密切相關(guān)的靶基因中,選取2個表達(dá)量高且變化倍數(shù)顯著的基因(FAD3和FAD6),進(jìn)行基因克隆、生物信息學(xué)分析及預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu),為后續(xù)使用基因工程手段改良小桐子抗冷性提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

第 1 章 研究背景效地提高其抗冷能力，這在玉米、茄子、番茄、棉花和煙草上均表現(xiàn)為經(jīng)過低溫鍛煉的的植株較未經(jīng)過低溫馴化的植株有更好的增長趨勢[38-39]。我們實(shí)驗(yàn)室前人的研究證實(shí)小桐子幼苗經(jīng)過 12 ℃低溫鍛煉，與未經(jīng)過低溫鍛煉相比，在 1 ℃低溫脅迫下，低溫鍛煉能顯著提高低溫脅迫下小桐子幼苗葉片和莖中抗氧化酶如氧化物酶、過氧化氫酶、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶、脫氫抗壞血酸還原酶與單脫氫抗壞血酸還原酶等的活性，提高抗壞血酸和還原型谷胱甘肽的含量，且通過抗氧化酶和抗氧化劑的協(xié)同作用，降低小桐子幼苗中丙二醛含量的積累和電解質(zhì)的滲漏，減緩由于低溫脅迫而導(dǎo)致的活性氧損傷和膜損傷，抑制甜菜堿醛脫氫酶、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，最終誘導(dǎo)幼苗葉片和莖中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如甜菜堿、脯氨酸、可溶性糖等的積累生物合成，在低溫脅迫過程中降低小桐子幼苗葉片的滲透勢和水勢，提高小桐子幼苗對低溫脅迫的抵抗能力[14-15]；研究表明，以冷敏植物臨界生長溫度12 ℃對小桐子幼苗進(jìn)行低溫鍛煉能顯著提高低溫脅迫下小桐子的抗冷性，且研究表明 12 ℃低溫鍛煉 2d 的效果最佳，可明顯提高小桐子抗冷性[14-15]（圖 1.1）。AB

第 1 章 研究背景個突出核苷酸[54]。隨后，DCL1 酶在核酸 CAP 結(jié)合復(fù)合體(CBC)的輔助下e-miRNA 切割成 miRNA::miRNA*二聚體雙鏈結(jié)構(gòu)。miRNA::miRNA*復(fù)合甲基化轉(zhuǎn)移酶（HENI）識別，雙鏈復(fù)合體中兩條鏈 3'末端的 2'核糖羥基發(fā)基化，提高復(fù)合體的穩(wěn)定性[55]。甲基化后 miRNA::miRNA*雙鏈復(fù)合體在植內(nèi)的 HST(HASTY)蛋白幫助下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，miRNA::miRNA*雙鏈復(fù)合過細(xì)胞質(zhì)中的解旋酶作的用形成成熟的單鏈miRNA和miRNA*序列，miRN在 miRNA 加工成熟過程中與其互補(bǔ)的大約 22 個核苷酸的 RNA 序列；最熟的單鏈 miRNA 與 AGO(Argonaute)等蛋白形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合NA-Induced Silencing Complex，RISC)，對靶基因行使調(diào)控的功能，而單鏈iRAN*則在體內(nèi)被降解[56-57]。
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q945.78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2634289