發(fā)布時(shí)間：2020-04-13 10:05

【摘要】：綠原酸水解活性酶類(lèi)泛指可以水解綠原酸的一類(lèi)酶,主要包括綠原酸水解酶和阿魏酸酯酶2類(lèi)。綠原酸水解活性酶類(lèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)綠原酸的生物降解,在食品和醫(yī)藥等行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)室前期篩得一株高產(chǎn)綠原酸水解活性酶類(lèi)的曲霉屬真菌SD14,其野生酶具有良好的穩(wěn)定性和底物親和力,但綠原酸水解活力較低(4.35 U/g)。本研究完成了對(duì)該菌株的全基因組測(cè)序,根據(jù)注釋信息篩選,對(duì)可能編碼綠原酸水解活性酶類(lèi)的4個(gè)基因進(jìn)行克隆,并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的可溶性表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化,最終獲得2個(gè)具有綠原酸水解活性的重組酶reFAE1和reFAE2,并進(jìn)一步對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)交叉比較菌株SD14的ITS區(qū)、鈣調(diào)蛋白和β-微管蛋白基因序列信息,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),提高菌種鑒別分辨率,最終確定其為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),與日本曲霉(A.japonicus)親緣關(guān)系近。采用第三代單分子測(cè)序技術(shù)完成了對(duì)該菌株的全基因組測(cè)序、組裝和功能注釋工作,所得基因組序列總長(zhǎng)為36.18Mb,包含18條scaffolds,GC含量為50.11%,組裝質(zhì)量遠(yuǎn)超過(guò)已有報(bào)道。(2)以實(shí)驗(yàn)室篩得的曲霉屬真菌(A.aculeatus SD14)的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得基因組中可能具有綠原酸水解活性的4個(gè)注釋基因(GME3292/7542/2693和11122),最終在E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得可溶性表達(dá)。其中2個(gè)基因工程菌GME3292-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)和GME11122-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)表達(dá)的重組酶檢測(cè)到綠原酸水解活性,分別命名為reFAE1和reFAE2。(3)從誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)4個(gè)方面對(duì)GME3292-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)和GME11122-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵條件優(yōu)化,確定最佳誘導(dǎo)條件為:OD_(600)=1.2,誘導(dǎo)溫度為20°C,誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為20 h,IPTG濃度分別為:0.04和0.02 mmol/L。最終綠原酸水解活力分別為246.37和340.95 U/g,是原始菌株的56.64和78.38倍,較已報(bào)道最高綠原酸水解酶活提高43%。(4)通過(guò)親和鎳柱層析色譜法對(duì)重組酶進(jìn)行分離純化,純化所得reFAE1和reFAE2均為同源二聚體,其單體相對(duì)分子質(zhì)量均在55 kDa左右。重組酶對(duì)4種模型底物均有水解活力,其中對(duì)咖啡酸甲酯的水解活性最高,香豆酸甲酯次之,阿魏酸甲酯和芥子酸甲酯的水解活性相對(duì)較低,對(duì)天然底物綠原酸的水解活性與香豆酸甲酯接近。根據(jù)底物特異性初步推測(cè),reFAE1和reFAE2均屬于C型阿魏酸酯酶。(5)reFAE1和reFAE2水解綠原酸的最適溫度分別為60℃和50℃,最適pH均為7.0,在30~50℃條件下具有良好的熱穩(wěn)定性。reFAE1和reFAE2分別在pH 3.0~8.0和pH 3.0~10.0條件下穩(wěn)定。Mn~(2+)和Ca~(2+)對(duì)reFAE2有一定程度的激活作用。EDTA處理對(duì)重組酶綠原酸水解活性基本沒(méi)有影響,一價(jià)金屬離子對(duì)酶活無(wú)顯著影響,二價(jià)金屬離子會(huì)對(duì)酶活造成一定程度的抑制,三價(jià)金屬離子處理后酶活損失嚴(yán)重。重組酶對(duì)綠原酸底物親和能力較好,K_m分別為79.85μmol和105.98μmol。
【圖文】：

第一章 緒論1 綠原酸及其對(duì)食品加工的影響廣義的綠原酸指由一個(gè)或多個(gè)咖啡酸和奎尼酸縮合而成的酯類(lèi)，根據(jù)置和數(shù)目可大致分為單酯、二酯、三酯和四酯4類(lèi)[1]，，目前已從自然界植發(fā)現(xiàn)的單酯類(lèi)綠原酸異構(gòu)體有綠原酸（5-咖啡�？崴幔㈦[綠原酸（4-奎尼酸）、新綠原酸（3-咖啡酰奎尼酸）3 種。狹義的綠原酸（Chlorogid，CGA）僅指由單個(gè)咖啡酸與奎尼酸縮合形成的縮酚酸，是植物有氧莽草酸途徑代謝產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)化合物[2]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1-1 所A 廣泛存在于自然界植物體中，在咖啡豆、蘋(píng)果、土豆、向日葵種子及（如杜仲、金銀花等）中含量尤為豐富。研究表明，CGA 是重要的生物質(zhì)[3]，具有抗菌[4, 5]、抗病毒[6, 7]、抗氧化[8]、降血壓、降血脂[9]和興奮中10]等多種生理功能。

圖 1-2 ChlH 催化反應(yīng)式Fig. 1-2 The catalyzed reaction formulas of ChlH2007 年，Benoit 等[26]分離純化得到 ChlH，對(duì)其蛋白質(zhì)一級(jí)序列進(jìn)行比，結(jié)果顯示 ChlH 與真菌產(chǎn)羧酸酯酶和膽酰酯酶的氨基酸序列具有相對(duì)較似性，約為 41%和 35%。推測(cè)其屬于 α/β 折疊水解酶家族，其催化三聯(lián)中心由 204位絲氨酸、325 位谷氨酸和 390 位組氨酸組成。預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)模型所示，其中包含 11 個(gè) β-折疊和 9個(gè) α-螺旋結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;TS201.25

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本文編號(hào)：2625888