【摘要】：乳糖是哺乳動物乳汁及乳制品中存在的主要碳水化合物,當人們飲用牛奶后,在消化過程中乳糖必須被β-半乳糖苷酶催化水解為半乳糖和葡萄糖才能被機體吸收利用。據報道,世界上約有十分之一的人由于體內缺乏β-半乳糖苷酶而患有乳糖不耐受癥;飲用牛奶后,身體會出現腹瀉、嘔吐等不良反應。其中,β-半乳糖苷酶具有很大的商業(yè)利用情景,性質優(yōu)良的β-半乳糖苷酶在生產生活中具有重要的實用價值。β-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶的一種,廣泛存在于自然界中。根據氨基酸序列的相似性,將β-半乳糖苷酶歸入五種糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GH)家族,包括1、2、35、42和59家族。其中,部分β-半乳糖苷酶除了具有水解活性以外,還具有轉糖基活性。目前,對β-半乳糖苷酶的研究較多,但尚未有來源于動物胃腸道且具有轉糖基活性的β-半乳糖苷酶報道,以及很少有報道具有耐鹽性的β-半乳糖苷酶;由于β-半乳糖苷酶被廣泛應用于食品工業(yè)、醫(yī)學和生化分析等鄰域,耐鹽與否與其運用前景息息相關。本論文研究的β-半乳糖苷酶來源于滇金絲猴糞便微生物宏基因組DNA,通過PCR克隆得到基因galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15,配合pEASY-E2載體和宿主Escherichia coli BL21(DE3)菌種構建原核表達系統(tǒng),分別對其進行異源表達和純化,并對純化后的重組酶galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15進行酶學性質研究,結果表明:(1)重組酶galRBM20_1最適pH為5.0,在pH 4.0-7.0之間仍能保持70%及其以上的活性,在pH 5.0-8.0的范圍內具有良好的穩(wěn)定性;最適溫度為45℃,37℃和45℃下具有良好的穩(wěn)定性;大多數金屬離子和化學試劑對該酶的活性都具有激活作用;其耐鹽性較強,當反應環(huán)境中有適當濃度的NaCl或是經一定濃度范圍內的NaCl處理后,能明顯提高酶的活力。(2)重組酶galRBM20_2最適pH為7.0,在pH 7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;在pH 5.0-7.0的范圍內具有良好的穩(wěn)定性;該酶溫度穩(wěn)定性良好,最適溫度為45℃,55℃處理1 h后還具有45%以上的活性;大多數金屬離子和化學試劑對該酶的活性都具有激活作用;該酶具有良好的耐鹽性,經一定濃度范圍內的NaCl處理后,酶的活力明顯提高。(3)重組酶galRBM20_13最適pH為7.0,在pH 7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;最適溫度為45℃,在37℃、45℃、50℃和55℃下穩(wěn)定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg~(2+)、Fe~(2+)對該酶的活性具有明顯的激活作用;該酶具有良好的耐鹽性,且一定濃度范圍內的NaCl處理能提高酶的活力。(4)重組酶galRBM20_15最適pH為8.0,在pH 7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;galRBM20_15受pH的激活作用較強,在pH 5.0-10.0的范圍內處理1 h后,酶活均在100%以上,其中pH 10處理1h后,相對酶活達到180%以上;最適溫度為45℃,50℃和55℃下穩(wěn)定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg~(2+)、Mn~(2+)對該酶的活性具有明顯的激活作用;該酶具備一定的耐鹽性,當反應環(huán)境中有2 M的NaCl存在時,仍具有55%的活性。TLC檢測結果表明,重組酶galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15除了能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖以外,還具有轉糖基活性;為此,本研究獲得的β-半乳糖苷酶不僅能很好的水解乳清、干酪和牛乳(pH 5.0-7.0),而其在具有鹽溶液的反應中能發(fā)揮良好的反應潛能,較適應β-半乳糖苷酶的廣泛用途。
【圖文】：

第 1 章 緒論2圖1.1 糖苷水解酶催化機制[2]Fig. 1.1 Glycosidases mechanisms[2]1.1 β-半乳糖苷酶的研究概況β-半乳糖苷酶的研究促使了微生物學的快速發(fā)展。例如，法國的雅各(Jacob)和莫諾德(Monod)[6]基于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的研究，提出了乳糖操縱子的理論和酶生物合

的 C-1 位置，使乳糖的β-D-(1, 4)、β-D-(1, 6)或β-D-(1, 3)糖苷鍵斷裂，生成葡萄糖和半乳糖基-酶復合物。然后，溶液中的水分子向陰離子巰基提供一個質子(H+)，形成帶負電荷的底物(含 OH-)進攻酶活性中心半乳糖基的 C-1 位置，形成半乳糖，并將電子傳遞給咪唑基，酶分子還原，繼續(xù)參與下一個酶促反應[54,56]。過程為：(1) 酶-乳糖→半乳糖苷-酶+葡萄糖，(2) 半乳糖苷-酶+受體→半乳糖苷-受體+酶。反應第二步在酶的作用下，β-半乳糖苷被轉移到含羥基的親核受體(水和糖類都可作為受體)上，受體為水時生成半乳糖，為水解反應，受體為乳糖或半乳糖等糖類時，則為轉糖基反應。乳糖為二糖，在水解為單糖半乳糖和葡萄糖的過程中，當羥基獲得質子，且底物進攻半乳糖的 C-1 位置時，形成的產物即為 GOS[56,57]。如第二步反應，若羥基的受體是乳糖水解產生的半乳糖或葡萄糖，則生成聚半乳二糖[58]；若羥基的受體是乳糖，則生成低聚半乳三糖；生成的三糖也可以作為羥基的受體，生成四糖；以此類推，，可生成更高的低聚半乳糖，如圖 1.2 所示。通常情況下，當反應體系中乳糖濃度低于水的濃度時，反應類型主要為水解[43,59]，生成的低聚半乳糖很少。因此，如果要提高低聚半乳糖的產量，可通過提高反應體系中底物(受體)的濃度或降低水的濃度實現[60]。
【學位授予單位】：云南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q55

【參考文獻】

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本文編號：2621689