【摘要】：硫化氫(H2S)是一種新型的氣體信號(hào)分子,參與生物體內(nèi)多個(gè)生理過(guò)程,包括凋亡、血管穩(wěn)態(tài)和再生、神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)、細(xì)胞保護(hù)以及炎癥調(diào)節(jié)等方面。H2S在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為硫烷硫,二者通常共存,最近的很多研究表明,在某些生物學(xué)現(xiàn)象中,可能硫烷硫才是潛在的信號(hào)分子。硫烷硫(sulfane sulfur)在體內(nèi)普遍存在,扮演著調(diào)節(jié)和抗氧化的角色,主要包括有機(jī)過(guò)硫化物(R-SSH),有機(jī)多硫化物(R-SSnH或RSSnR,n≥2)和無(wú)機(jī)多硫化物(H2Sn,n≥2)三類。硫烷硫和硫醇有很大的不同,后者主要表現(xiàn)為親核性,而硫烷硫既有親核性又有親電性。硫烷硫可由H2S的硫氧化途徑、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸的代謝途徑產(chǎn)生,其中間產(chǎn)物GSSH是線粒體和異養(yǎng)細(xì)菌硫化物氧化途徑中的關(guān)鍵產(chǎn)物�；钚粤蛲榱蛲ㄟ^(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的半胱氨酸殘基進(jìn)行修飾,形成過(guò)硫化物(R-SSH)的形式后改變酶活,或以信號(hào)傳遞的方式調(diào)節(jié)生物體的活性,從而影響生理過(guò)程。硫氰酸酶(rhodanese),廣泛存在于多種細(xì)胞內(nèi),催化機(jī)制之一就是通過(guò)形成酶的中間體R-SSH,將硫烷硫從硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移給氰化物從而達(dá)到氰化物解毒的目的。越來(lái)越多的證據(jù)表明活性硫烷硫在體內(nèi)的重要性,而更好地了解與生物密切相關(guān)的硫烷硫的生化特性將有助于推動(dòng)這一領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。目前用于硫烷硫的檢測(cè)方法有很多,包括硫化學(xué)發(fā)光法、離子色譜法、多硫化物(polysulfides,H2Sn)衍生物的高效液相色譜分析和H2Sn敏感熒光染料的應(yīng)用。這一類的方法都是基于化學(xué)反應(yīng)來(lái)檢測(cè),目前還未見(jiàn)一種能夠?qū)崟r(shí)探測(cè)活性硫烷硫的非化學(xué)反應(yīng)方法報(bào)道。H2S的濃度至關(guān)重要,其生物毒性表現(xiàn)為明顯的劑量效應(yīng),高濃度的H2S會(huì)對(duì)線粒體中細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)的活性產(chǎn)生抑制作用,進(jìn)而影響電子傳遞,抑制呼吸作用等。有些異養(yǎng)細(xì)菌能夠氧化硫化氫生成多硫化物(在硫醌氧化還原酶SQR和過(guò)硫化物雙加氧酶PDO的作用下),進(jìn)一步氧化成亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽,氧化代謝產(chǎn)物的毒性則遠(yuǎn)小于H2S。Cupriavidus pinatubonensis JMP134是 β-變形菌綱的革蘭氏陰性菌,在芳香族化合物降解方面和生物技術(shù)等方面應(yīng)用廣泛。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),JMP134中存在一個(gè)硫氧化基因簇pdo-sqr,操縱子受到上游Fis家族的σ54依賴型轉(zhuǎn)錄因子FisR的調(diào)控。FisR具有增強(qiáng)子蛋白bEBP的典型結(jié)構(gòu),蛋白內(nèi)部分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域,R結(jié)構(gòu)域的三個(gè)半胱氨酸是感應(yīng)硫烷硫的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn);AAA+結(jié)構(gòu)域具有水解酶活性,D結(jié)構(gòu)域可以和啟動(dòng)子上游的序列結(jié)合。但FisR的調(diào)控模型尚不清楚,結(jié)構(gòu)域之間如何相互作用也不確定。為了解決以上問(wèn)題,本文開(kāi)發(fā)了一種快速、靈敏的熒光掃描光譜法對(duì)硫烷硫的熒光特性、FisR的調(diào)控機(jī)制及RhoD的催化功能開(kāi)展以下研究?jī)?nèi)容:1.用熒光分光光度計(jì)設(shè)置同步掃描激發(fā)光和發(fā)射光,對(duì)硫烷硫進(jìn)行熒光同步掃描光譜(resonance synchronous spectroscopy,RS2)的研究。通過(guò)對(duì) 14種含硫化合物的熒光同步掃描結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),只有當(dāng)分子內(nèi)部含有親電形式的S=S時(shí),硫烷硫才有RS2的特異性光譜;用RS2的方法,可以用于硫烷硫的生化性質(zhì)的分析,如pKa的測(cè)定,反應(yīng)動(dòng)力學(xué)速率測(cè)定,小分子蛋白過(guò)硫化物pH依賴的硫烷硫活性等。依據(jù)這一發(fā)現(xiàn),對(duì)無(wú)機(jī)多硫化物的生化特性進(jìn)行了研究,研究結(jié)果顯示無(wú)機(jī)多硫化物在低濃度下極不穩(wěn)定,在生理?xiàng)l件(pH7.4)下,會(huì)和胞內(nèi)的GSH快速發(fā)生反應(yīng),半衰期約為1min。質(zhì)子化的GSSH是親電體,具有熒光同步光譜的特征峰。解離的GSS'是親核體,易被氧化,不具備該特征峰。利用該特性確定了 GSSH的解離常數(shù)pKa為6.9。在pH7.4條件下,GSSH/GSS'和H202的二級(jí)反應(yīng)速率比H2S/HS'和H202高50倍,說(shuō)明類似于GSSH/GSS'的活性硫烷硫可能在胞內(nèi)起主要的抗氧化作用。半胱氨酸的過(guò)硫化修飾是細(xì)胞內(nèi)蛋白的常見(jiàn)修飾形式,參與了多種代謝過(guò)程,以負(fù)責(zé)氰化物解毒的兩種硫氰酸酶RhoD為模型,研究了蛋白活性位點(diǎn)口袋的功能,結(jié)果顯示半胱氨酸在胞內(nèi)的過(guò)硫化修飾狀態(tài)也存在兩種形式:a.去質(zhì)子化的形式(R-SS-),不顯示RS2特征峰,不能和亞硫酸鹽反應(yīng);b.質(zhì)子化形式(R-SSH),有RS2特征峰,可以和亞硫酸鹽反應(yīng)生成硫代硫酸鹽。用RS2的方法對(duì)大腸桿菌及其重組菌進(jìn)行了全細(xì)胞分析,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),熒光同步掃描RS2光譜的形狀、強(qiáng)度和硫烷硫的種類、濃度及緩沖體系pH都密切相關(guān),這在一定程度能夠揭示活性硫烷硫在胞內(nèi)分布的物質(zhì)種類和相對(duì)含量。RS2是一種利用物質(zhì)的熒光特性快速、靈敏、簡(jiǎn)便的測(cè)定活性硫烷硫的方法,可以揭示活性硫烷硫的新的生化性質(zhì),利用該方法測(cè)定的GSSH的pKa、動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)、H2Sn在不同pH值下的分布等,有望填補(bǔ)硫烷硫研究領(lǐng)域的空白。2.硫氧化途徑是異養(yǎng)菌C pinatubonensis JMP1 34產(chǎn)生硫i烷硫的重要來(lái)源之一,我們發(fā)現(xiàn)了一種新的依賴于σ54的轉(zhuǎn)錄因子,它既是硫化物感應(yīng)器,又是JMP134中硫化物氧化途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。當(dāng)胞內(nèi)多余的H2S轉(zhuǎn)化為多硫化物時(shí),FisR激活σ54依賴的操縱子轉(zhuǎn)錄,來(lái)降低H2S的濃度,減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用。我們首先確定了 FisR蛋白的三個(gè)半胱氨酸是感應(yīng)多硫化物的關(guān)鍵位點(diǎn),進(jìn)一步研究了 FisR結(jié)合在pdo-sqr 操縱子上游的具體位點(diǎn)及其通過(guò)ATP水解酶活性激活下游基因轉(zhuǎn)錄的方式。轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)自身的聚合狀態(tài),常見(jiàn)的調(diào)節(jié)方式有D結(jié)構(gòu)域結(jié)合在操縱子上游或R結(jié)構(gòu)域的磷酸化。FisR轉(zhuǎn)錄因子的蛋白聚合是依賴R結(jié)構(gòu)域的,蛋白表達(dá)后隨即形成六聚體結(jié)合在JMP134的pdo-sqr操縱子上游的調(diào)控區(qū):大多數(shù)σ54依賴型調(diào)控因子對(duì)于AAA+結(jié)構(gòu)域的水解酶活性是負(fù)調(diào)控的,而我們的研究證明FisR屬于多硫化物激活后的正調(diào)控。針對(duì)以上研究結(jié)果,提出了 FisR轉(zhuǎn)錄因子對(duì)外界硫化物壓力產(chǎn)生快速應(yīng)答的“待命狀態(tài)”模型,該模型的核心機(jī)制是:本底表達(dá)的少量SQR蛋白將外源多余的硫化物轉(zhuǎn)化為多硫化物(Km值較低,反應(yīng)易發(fā)生),激活FisR轉(zhuǎn)錄因子,FisR通過(guò)自身的水解酶活性起始下游基因的轉(zhuǎn)錄。從生物信息學(xué)的角度分析FisR同源的調(diào)控蛋白可能是含有pdo-s科r基因簇的異養(yǎng)菌抵抗外界環(huán)境中硫化物壓力的一個(gè)共同的策略。3.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是研究的比較多的模式生物,在利用硫代硫酸鹽為硫源生長(zhǎng)時(shí)比利用硫酸鹽時(shí)產(chǎn)生更多的酒精。S.cerevisiae.的細(xì)胞內(nèi)有五種硫轉(zhuǎn)移酶,分別是Rd11、Rd12、Tuim1、Ych1和Uba4,其中Rd11和Rd12負(fù)責(zé)將硫代硫酸鹽的硫烷硫轉(zhuǎn)移給硫受體形成過(guò)硫化物和亞硫酸鹽,Tuim1(tRNA-thiouridine modification protein 1)在Urm1 系統(tǒng)的硫轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用。DUF442是Cupriavidus pinanibonensis JMP134 中CpSQR(硫醌氧化還原酶,Reut 3588)的一個(gè)結(jié)構(gòu)域,不但具有硫氰酸酶的性質(zhì),還在硫氧化系統(tǒng)中參與硫化物的代謝,一方面它能加速SQR的產(chǎn)物多硫化物和GSH的反應(yīng)速度,另一方面催化GSSH和S032'的反應(yīng)。DUF442結(jié)構(gòu)域由128個(gè)氨基酸組成,其中有2個(gè)半胱氨酸殘基,分別位于34位和94位,只有94位的半胱氨酸為保守的活性位點(diǎn)。將與GSSH孵育后的DUF442蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示34位和94位的半胱氨酸都會(huì)被修飾,且修飾的蛋白過(guò)硫化物在pH7.4條件下能夠檢測(cè)到明顯的熒光同步光譜,但94位半胱氨酸突變的DUF442突變體沒(méi)有熒光光譜。利用RS2的方法測(cè)定了 Cys34-SSH的pKa為6.29。因此在生理?xiàng)l件下,只有野生型的和34位半胱氨酸突變的C94-SSH才能將硫烷硫轉(zhuǎn)移給亞硫酸鹽形成硫代硫酸鹽。以 Rd12 和 DUF442 為研究模型,分別選擇 Saccharowyces cerevisiae(PDB ID:3DIP,分辨率0.98 A,相似性40%),和 Neisseriaa meningitidis z2491(PDB ID:2F46,分辨率1.41 A,相似性39%)的結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行了 3D同源建模的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)RhoD蛋白的催化活性位點(diǎn)呈口袋形狀,保守的半胱氨酸位于口袋的底部,周圍的堿性氨基組成了一個(gè)強(qiáng)靜電場(chǎng)結(jié)構(gòu),因此蛋白過(guò)硫化物protein-SSH在口袋內(nèi)部會(huì)呈現(xiàn)質(zhì)子化狀態(tài),而不會(huì)解離成protein-SS-的形式,因此具有RS2熒光同步掃描光譜和親電性。本文首次解析了Rd12過(guò)硫化物(RhoD-SSH)的晶體結(jié)構(gòu),分辨率為2.47 A,RhoD-SSH是硫轉(zhuǎn)移反應(yīng)的關(guān)鍵中間體,精氨酸殘基對(duì)催化位點(diǎn)起關(guān)鍵作用,突變后會(huì)顯著影響RhoD的酶活性,thiosulfate孵育的Rd12蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示Rd12的氨基酸被過(guò)硫化修飾形成Rd12-SSH的形式,和復(fù)合物蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致。綜上,本論文分析了活性硫烷硫的代表化合物,包括多硫化物和過(guò)硫化物的理化性質(zhì)和熒光特性等,并對(duì)與硫烷硫密切相關(guān)的代表性蛋白(硫代謝調(diào)控蛋白和硫轉(zhuǎn)移蛋白)在體內(nèi)的生理功能進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步揭示硫烷硫在生物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)作用和信號(hào)傳遞的機(jī)制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【圖文】：

ＣＢＳ主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟中，３－ＭＳＴ主要位于線粒體內(nèi)，逡逑與半胱氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ｃｙｓｔｅｉｎｅ邋ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣＡＴ）共同產(chǎn)生Ｈ２Ｓ［９，１０，１１，１２］。逡逑圖１．１ｂ概述了哺乳動(dòng)物Ｈ２Ｓ內(nèi)源產(chǎn)生的途徑［１３］。逡逑Ｈ２Ｓ在細(xì)菌體內(nèi)的產(chǎn)生方式主要有三種：ａ．硫酸鹽還原細(xì)菌（ｓｕｌｆａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ逡逑ｂａｃｔｅｒｉａ，邋ＳＲＢ）的硫酸鹽還原作用；ｂ．硫細(xì)菌（ｓｕｌｆｉｉｒ邋ｂａｃｔｅｒｉａ）對(duì)單質(zhì)硫的還原；逡逑ｃ．異養(yǎng)微生物胞內(nèi)產(chǎn)生Ｈ２Ｓ。逡逑Ｒｎｙｉｒｕｎｍｅｎｕｌ邋ＨｉＳ邐ＭｔｃｒｏｂＵｌＨｊＳ逡逑  邋一逡逑Ｉ＞ＳＲ逡逑ＭＶ逡逑ｔ邋？邋Ｔ邋Ｖ邐３ＭＳＴ逡逑（ａ）邐（ｂ）逡逑Ｉｎｌｒａｉｒｌｌｕｌａｒ邋Ｈ？Ｓ逡逑＜邋Ｉ）邋ＰｒｏｄｕｔｉｌＫｉｎ邐（２）邋Ｍｏｒａｇｒ邐（３）邋Ｉ邋Ｖｇｒａ？ｌ？ｔｈｉｎ逡逑ＣＢＳ逡逑圖１．１丨丨２Ｓ的來(lái)源丨１３｜。（ａ）環(huán)境中的Ｈ２Ｓ來(lái)源與火山、硫礦、熱泉等；（ｂ）微生物產(chǎn)生Ｈ２Ｓ，逡逑亞硫酸鹽還原酶還原硫酸鹽到比５，某些細(xì)菌利用和哺乳動(dòng)物同源的ＣＢＳ，邋ＣＳＥ和３－ＭＳＴ酶逡逑降解半胱氨酸產(chǎn)生Ｈ２Ｓ；邋（ｃ）內(nèi)源性Ｈ２Ｓ的產(chǎn)生途徑主要有半胱氨酸降解、硫烷庫(kù)的活性硫逡逑轉(zhuǎn)化為Ｈ２Ｓ、線粒體中硫氧化代謝途徑；逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｓｕｌｆｉｄｅ［１３］．邋（ａ）邋Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｓｕｌｆｉｄｅ邋（Ｈ２Ｓ）邋ｏｃｃｕｒｓ邋ｄｕｅ逡逑ｔｏ邋ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｓｕｃｈ邋ａｓ邋ｖｏｌｃａｎｏｅｓ

１．２．１胱硫醚個(gè)裂解酶ＣＳＥ逡逑ＣＳＥ主要催化ＰＬＰ邋（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ邋５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）依賴的半骯氨酸和同型半逡逑胱氨酸產(chǎn)生丙酮酸和ａ－酮戊二酸的反應(yīng)，同時(shí)釋放出氨（ＮＨ３）和Ｈ２Ｓ邋（圖１．２）。逡逑ＣＳＥ主要位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，多分布于心血管系統(tǒng)中，，并被認(rèn)為是心臟病的可逡逑能藥物作用靶點(diǎn)，研宄表明調(diào)節(jié)ＣＳＥ的活性對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化和其他心血管逡逑疾病的動(dòng)物模型有一定的影響［１４］。最近的研宄表明，ＣＳＥ產(chǎn)生的Ｈ２Ｓ對(duì)減輕心逡逑肌缺血－再灌注（Ｉ／Ｒ）損傷和減輕心律失常減少心肌梗死等方面具有許多保護(hù)作用逡逑［１５，１６］。除了參與心血管系統(tǒng)的活動(dòng)外，ＣＳＥ還有助于其他器官的細(xì)胞信號(hào)的傳逡逑遞和穩(wěn)態(tài)。例如Ｌｅｆｅｒ等發(fā)現(xiàn)，抑制ＣＳＥ可減輕Ｄ－半乳糖胺和脂多糖（ＬＰｓ）引起逡逑的肝損傷［１７］，這一影響是由于細(xì)胞內(nèi)硫代硫酸鹽和同型半胱氨酸水平增加，逡逑ＮＦ－Ｅ２邋Ｐ４５因子２（Ｎｒｆ２）和抗氧化蛋白等復(fù)雜因素的上調(diào)所導(dǎo)致的。逡逑１．２．２胱硫醚－Ｐ－合成酶ＣＢＳ逡逑ＣＢＳ催化的是ＰＬＰ依賴的反應(yīng)，其中Ｌ－同型半胱氨酸和Ｌ－絲氨酸反應(yīng)生成逡逑Ｌ－胱硫醚和Ｈ２Ｏ［１０］。在Ｌ－半胱氨酸存在的條件下
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q25

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本文編號(hào)：2621536