【摘要】：小鼠早期胚胎的細胞極性和世系特征對后續(xù)發(fā)育至關重要。然而,在內細胞團/滋養(yǎng)層世系命運決定事件中,關于細胞極性如何決定世系命運的確切信號轉導機制仍不清楚。我們從研究極性蛋白PATJ/MPDZ在早期胚胎發(fā)育過程中的作用出發(fā),揭示細胞極性與世系命運決定的關系。首先,我們運用RT-PCR、熒光實時定量PCR以及免疫細胞化學等技術方法檢測CRB極性蛋白復合體在小鼠植入前胚胎中的表達定位模式。結果顯示:CRB3從2-細胞胚胎開始表達,在8-細胞胚胎階段表達量升高,一直持續(xù)到囊胚;PALS1在植入前胚胎的每個階段都有不同程度的表達,但沒有顯著性差異;PATJ從受精卵到4-細胞胚胎呈中等水平表達,在8-細胞胚胎階段表達量升高,一直持續(xù)到囊胚;MPDZ從致密化8-細胞胚胎開始表達,并且呈低水平表達。從蛋白質定位上看,CRB極性蛋白復合體各組分在致密化8-細胞胚胎之前未呈現(xiàn)極性定位,均勻分布在整個胚胎的所有卵裂球中;從致密化8-細胞胚胎開始,CRB極性蛋白復合體開始出現(xiàn)極性分布,CRB3和PALS1定位在外部細胞的頂端膜上,PATJ和MPDZ定位在外部細胞的緊密連接處。這樣的表達模式提示:CRB極性蛋白復合體的極性分布可能參與調控胚胎的世系分化。其次,我們運用RNA干擾的方法,特異性的敲減Patj/Mpdz基因的表達。結果發(fā)現(xiàn)單純的敲減Patj基因僅可以從一定程度上抑制囊胚的形成,但是仍有接近一半的胚胎可以正常發(fā)育;同時敲減Patj/Mpdz基因可以抑制72.7%的胚胎發(fā)育到囊胚,而且即使發(fā)育到囊胚,這些胚胎也不能正常的進行滋養(yǎng)層世系分化擴張。這些的結果說明了通過shRNA干擾降低Patj/Mpdz基因的表達可以有效降低囊胚的形成率。結果提示:極性蛋白PATJ/MPDZ可能在囊胚形成中起到重要的調控作用。再次,我們進一步研究Patj/Mpdz基因調控滋養(yǎng)層世系分化的機制,通過免疫細胞化學和細胞骨架染色的方法,對CRB極性蛋白復合體、細胞骨架、E-鈣粘連蛋白和ZO-1進行染色。結果顯示,敲減Patj/Mpdz基因導致CRB極性蛋白復合體、細胞骨架及ZO-1的定位紊亂,但是不影響E-鈣粘連蛋白的定位。由此可見:敲減Patj/Mpdz基因不影響胚胎的正常致密化,但是破壞了胚胎的頂端-基底側極性、細胞骨架以及TJ的結構穩(wěn)定,最終導致囊胚發(fā)育異常。最后,我們探討了Hippo通路在敲減Patj/Mpdz基因抑制囊胚發(fā)育中的作用。我們通過免疫細胞化學的方法追蹤YAP的定位情況,用以指示Hippo通路的調節(jié)狀態(tài)。結果顯示:敲減Patj/Mpdz基因導致YAP的定位紊亂,內-外部細胞中的YAP均磷酸化形成p-YAP,致使TE的特異性轉錄因子CDX2表達減弱,最終導致外部細胞失去滋養(yǎng)層世系的特征。結果表明:極性蛋白PATJ/MPDZ通過調控植入前胚胎外部細胞的Hippo通路來維持TE的形成。綜上所述:極性蛋白PATJ/MPDZ在植入前胚胎中具有穩(wěn)定胚胎極性、細胞骨架以及緊密連接的作用,并且通過調節(jié)Hippo通路進而調控胚胎的內細胞團/滋養(yǎng)層世系分化。
【圖文】：

第二章 CRB 極性蛋白復合體在小鼠植入前胚胎中的表達定位驗證。Crb3基因在哺乳動物中還有兩個同系物，即Crb1基因和Crb2基腦和視網(wǎng)膜中表達（Hollander et al，2002），而Crb2基因在腎，在心臟、肺和胎盤中低水平表達（Ja et al，2005）。Crb2 mR過程中未被檢測到，，而Crb1 mRNA只能在受精卵和2細胞胚胎中入前胚胎中的mRNA水平相當?shù)停▓D2-2）。

2-1 CRB極性蛋白復合體 mRNA在小鼠植入前胚胎中ion of CRB Polarity Protein Complex mRNA in mouse P白復合體各組分在植入前胚胎典型發(fā)育階段的表達情況。Zy胞胚胎；c8c：致密化8細胞胚胎，Mo：桑葚胚；Bl：囊胚；Gf CRB polarity Protein Complex Components by RT-PCR in they: Zygote; 2-c: 2-cell embryo; 4c: 4-cell embryo; 8c: 8-cell emastocyst; Gapdh was employed as loading control. The experimen
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q132

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本文編號：2615826