【摘要】：目前所開采利用的大多數能源屬于不可再生能源,終究會開采殆盡。纖維素生物質因其豐富可再生的特點提供了成為替代能源的可能,纖維素生物質的利用成為了關鍵所在。木質纖維素能夠經過一系列的酶促反應降解生成單糖,進而可轉化為可利用的能源物質,因此高效快速的降解纖維素成為技術突破的重要方向。本文以嗜熱毛殼菌AA9家族(Auxiliary Activity family 9)的多糖單加氧酶(PMO)為研究對象,將酶經畢赤酵母表達,對酶的最適反應溫度、pH等性質進行探索;通過對酶降解磷酸膨脹纖維素后的產物運用TLC薄層層析法、基質輔助激光解析電離飛行質譜(MALDI-TOF-MS)等方法進行分析以確定PMO氧化的區(qū)域選擇性;并測定PMO對外切纖維素酶CBH1,內切纖維素酶EG1和β-葡聚糖酶CT2三種纖維素酶的協(xié)同作用。本文將嗜熱毛殼菌經微晶纖維素誘導培養(yǎng)后提取RNA并反轉錄為cDNA,設計引物進行PCR擴增得到12個完整的PMO基因片段。選擇pPICZαA酵母甲醇誘導型表達載體構建pPICZαA-PMO重組表達載體質粒,將載體質粒經電擊轉化構建PMO酵母工程菌,工程酵母菌經甲醇誘導發(fā)酵7 d表達蛋白,用硫酸銨沉淀法沉淀后經蛋白純化儀純化蛋白,SDS-PAGE檢測蛋白純度和分子量大小,選擇表達量高的PMO0728,PMO0762,PMO5456,PMO6622,PMO14091五個PMO蛋白繼續(xù)后續(xù)試驗。通過設置一系列的溫度梯度和pH梯度分別反應,確定多糖單加氧酶的最適反應溫度為50°C,反應最適pH為5.0。在最適反應條件下用表達的5種酶分別降解磷酸膨脹纖維素,然后對反應產物進行TLC分析,PMO5456產物量更多,活性最好,所以以PMO5456為后續(xù)試驗研究對象。對PMO5456降解PASC產物進行的TLC分析顯示可溶性產物中含有G2-G6寡糖,證明該酶具有降解PASC的活性。為進一步確定PMO5456的氧化作用方式,對其反應產物進行MALDI-TOF-MS分析,根據峰值大小對應分子量進行分析,產物中有C1氧化寡糖(aldonic acid,m/z+16)峰值和C4氧化寡糖(C4-ketoaldose,m/z-2)或C6氧化寡糖(C6-hexodialdose,m/z-2)的峰值�？梢源_定的是有C1氧化,但是無法區(qū)分出C4和C6氧化的各自峰值。為區(qū)分出C4和C6氧化,本文采取溴水氧化的方式對底物進行進一步氧化,產物再次進行MALDI-TOF-MS分析。C1氧化寡糖不會被溴水氧化,分子量不變;C4氧化寡糖與溴水發(fā)生反應,氧化后生成產物的分子量相比較氧化前增加14;若存在C6氧化寡糖,也會被Br_2氧化,產物分子量相比較氧化前增加30;所以經Br_2氧化后,C4和C6產物分子量產生差異。MALDI-TOF-MS分析圖譜中的峰值可推斷PMO5456降解PASC過程中有C4氧化也有C6氧化。最終確定PMO酶的氧化方式是C1、C4和C6氧化。PMO作為輔助活性家族成員,對纖維素酶活性的提高作用是其重要特性。本文選取了來自嗜熱毛殼菌的CBH1,EG1和CT2三種酶,分別加入經過PMO5456預處理的PASC中,用DNS法測定酶活,并與原酶活進行比較,結果可見隨著PMO5456處理底物時間增加,三種纖維素酶活性隨之增加。PMO5456處理后,內切纖維素酶EG1的活性提高了3.6倍;外切纖維素酶CBH1提高了2.2倍;β-葡萄糖苷酶CT2的酶活提高了0.6倍。最終確定PMO5456的氧化方式包括C1,C4和C6。對不同纖維素酶的活性輔助作用有所區(qū)別,PMO5456對內切纖維素酶EG1的活性提高最明顯,外切纖維素酶次之,β-葡萄糖苷酶的酶活提高幅度較低。
【圖文】：

2 材料與方法2.1 材料2.1.1 試驗菌株與試劑嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophile）由本實驗室分離保存。畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115 購自 Invitrogen 公司。 T1 大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京全式金公司。酵母甲醇誘導型表達載體 pPICZαA（圖 2.1）購自 Invitrogen 公司。

3.1 PMOs 保守 motif 結構及進化分析試驗中對12個嗜熱毛殼菌蛋白成員通過使用MEME motif搜索工具進行保守motif分析，共發(fā)現了 8 個不同的保守 motif（圖 3.1）。結合進化分析，發(fā)現在整個嗜熱毛殼菌的蛋白質成員中均具有相似 motif 組成，表明嗜熱毛殼菌的所有 AA9 家族成員之間的功能具備相似性。進一步研究嗜熱毛殼菌的保守結構域發(fā)現，在聯配過后的 12 個AA9 序列中，每個 AA9 家族成員都具備 8 個結構域，但是他們在結構域的細節(jié)上卻存在不同程度的差異，在整個物種中 AA9 家族表現出整體相似，細節(jié)差異的相對保守的motif 特性。根據進化關系（圖 3.2），不難看出 AA9 家族的成員的保守性是極高的，同源性也相對較高，雖然在保守 motif 的順序和結構上有細微的差異，但是仍有相對保守的結構以確定相似的功能特征。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

【參考文獻】

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1 李青青;黃曉梅;范金霞;陳秀玲;孫旭東;李東玉;;木霉內切葡聚糖酶的研究現狀及應用[J];基因組學與應用生物學;2015年10期

2 周世豐;;從“農林廢棄物”到“生態(tài)經濟” 纖維素乙醇開啟生物能源利用新時代[J];中國石油和化工經濟分析;2014年10期

3 湯兆平;孫劍萍;;生物燃料可持續(xù)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)及對策研究[J];農機化研究;2014年03期

4 萬曉華;黃志群;;植物標志物在森林土壤碳循環(huán)研究中的應用[J];土壤學報;2013年06期

5 劉曉晶;李田;翟增強;;纖維素酶的研究現狀及應用前景[J];安徽農業(yè)科學;2011年04期

6 詹慧龍;嚴昌宇;楊照;;我國農業(yè)生物質能產業(yè)發(fā)展研究[J];改革與開放;2010年19期

7 ;能源技術展望2010[J];財經界;2010年08期

8 方詡;秦玉琪;李雪芝;王祿山;汪天虹;朱明田;曲音波;;纖維素酶與木質纖維素生物降解轉化的研究進展[J];生物工程學報;2010年07期

9 王鳳娟;黃峰;;生物質原料的酶解及其在制漿造紙工業(yè)中的應用[J];黑龍江造紙;2009年01期

10 孫智謀;周旭;劉麗萍;;生物質能源的研究與發(fā)展[J];糧食與飼料工業(yè);2009年02期

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本文編號：2612845