高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)及痛風(fēng)是由長期血尿酸水平升高引起的一類代謝性疾病。目前用于治療高尿酸血癥的西藥普遍存在較明顯的毒性不良反應(yīng)。因此,開發(fā)高效低毒的降尿酸活性物質(zhì)具有重要的意義。鏗魚(Skipjack tuna),俗稱炸彈魚,屬于金槍魚科,具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn),是制備生物活性肽的良好來源。本文以鰹魚背腹肉為原料,運(yùn)用可控酶解技術(shù)制備鰹魚黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)抑制肽,利用膜分離及親和超濾-液質(zhì)技術(shù)對其進(jìn)行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定,最后通過分子對接技術(shù)分析其構(gòu)效關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:(1)篩選了酶解優(yōu)化用的原料——鰹魚背腹肉。建立了測定肌肽、鵝肌肽含量的高效液相色譜法:采用氨基柱,流動相為50mM pH 6.8磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀緩沖溶液:乙腈=4:6,流速為lmL/min,柱溫為25 ℃,檢測波長為210nm。分別測定了鰹魚六個不同部位中肌肽、鵝肌肽的含量,發(fā)現(xiàn)鰹魚背腹肉中含量最高,故適合作為酶解底物。同時,測定鰹魚背腹肉的水分含量為70.43%,粗蛋白26.83%,灰分1.63%,脂肪1.36%,是一種高蛋白、低脂肪且營養(yǎng)豐富的食品來源。(2)確定了酶解制備鰹魚XOD抑制肽的最佳工藝條件。以水解度、氮回收率、XOD抑制活性、肌肽和鵝肌肽含量為響應(yīng)值,對酶解工藝中蛋白酶種類、加酶量、酶解pH和溫度等影響因素進(jìn)行了優(yōu)化,得到酶解的最優(yōu)工藝為:采用中性蛋白酶,加酶量為489.86 U/g,酶解pH為7.08,溫度為49.5 ℃,時間為5 h。在此條件下,鰹魚酶解產(chǎn)物的水解度為22.38%,氮回收率為83.31%,XOD抑制活性達(dá)到62.26%,肌肽和鵝肌肽含量分別為0.50 mg/g和24.50 mg/g(以干基計),與模型方程理論預(yù)測值基本一致。由本法所得的鰹魚XOD抑制肽以分子質(zhì)量低于1000 Da的寡肽為主。皮爾遜相關(guān)性分析表明,XOD抑制活性與肌肽或鵝肌肽含量無相關(guān)性,推測在酶解的過程中產(chǎn)生了其他具有XOD抑制活性的小分子肽。(3)膜分離鰹魚XOD抑制肽并進(jìn)行多種功能評價。采用1000、600和300 Da的聚酰胺膜對酶解優(yōu)化得到的鰹魚XOD抑制肽進(jìn)行膜分離,功能活性評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)600～1000 Da組分的XOD抑制活性最高,其IC50值是9.18 mg/mL,同時,該部分的抗氧化活性也最高,說明這部分產(chǎn)物能夠在減少尿酸生成的同時減緩伴隨產(chǎn)生的氧化應(yīng)激造成的損傷;300～600 Da組分的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性最高,IC50 值為 0.12 mg/mL。(4)親和超濾-液質(zhì)技術(shù)分離鑒定得到具有XOD抑制活性的五肽——Ala-Cys-Glu-Cys-Asp(ACECD)。人工合成后證實(shí),ACECD具有較強(qiáng)的XOD抑制活性,其IC50值為7.23 mg/mL。分子對接結(jié)果顯示,ACECD能夠進(jìn)入XOD中含Mo原子的活性中心,并通過氫鍵、疏水作用力及范德華力等與活性中心周圍的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用,與XOD催化底物黃嘌呤之間存在競爭同一結(jié)合位點(diǎn)的現(xiàn)象。以上研究結(jié)果表明鰹魚蛋白肽具有潛在的降尿酸作用,值得進(jìn)一步深入挖掘。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS254.4
【部分圖文】：

或高嘌呤類食物所致［＞ｕ］。??體內(nèi)尿酸的生成主要由嘌呤類代謝相關(guān)酶控制，而尿酸的排泄主要由尿酸重??吸收蛋白和尿酸分泌蛋白調(diào)控（見圖１．１）。??１??

２．４結(jié)果與討論??２．４．１肌肽、鵝肌肽色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線??肌肽、鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖２．１。鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為１８．１０３?ｍｍ，??肌肽標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為２２．６２０?ｍｉｎ，兩者可以實(shí)現(xiàn)較好的分離。�。玻常敝胁煌�??濃度的肌肽、鵝肌肽混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行測定分析，得到肌肽、鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)??品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖２．２所示。將曲線進(jìn)行回歸分析，得到鵝肌肽回歸方程為：??ｙ＝０．５８６２ｘ＋９．３２６４，?Ｒ２＝０．９９８２；肌肽回歸方程為：ｙ＝０．９４２４ｘ＋１７．９８４，?Ｒ２＝０．９９８０。??２５００－?１４．３?２６３??２０００－??置祕??Ｉ?鵝肌肽?肌肽??Ｉ?１０００－??＜?＼?＼?．?｜２９?－?２２?６２０??３－３１６０?＼Ｗ２６－１８?１０３?＾?Ａ??＾?Ｊ??〇．?６?７７５?ｉ＾ｉａｉ〇ｇｅｉ５２?ｉ?｜?？尸？戈３?，??？５ＱＱＪ｜＿－?■?－■－丨－．…■?■?．．?■?．?■．．．－—??０．０?５．０?１０．０?１５．０?２０．０?２５．０?３０．０??時?Ｍ?［ｍｉｎｉ??圖２．１肌肽及鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖??Ｆｉｇ．?２．１?Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，?ｃａｒｎｏｓｉｎｅ?ａｎｄ?ａｎｓｅｒｉｎ

２．４結(jié)果與討論??２．４．１肌肽、鵝肌肽色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線??肌肽、鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖２．１。鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為１８．１０３?ｍｍ，??肌肽標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為２２．６２０?ｍｉｎ，兩者可以實(shí)現(xiàn)較好的分離。�。玻常敝胁煌�??濃度的肌肽、鵝肌肽混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行測定分析，得到肌肽、鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)??品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖２．２所示。將曲線進(jìn)行回歸分析，得到鵝肌肽回歸方程為：??ｙ＝０．５８６２ｘ＋９．３２６４，?Ｒ２＝０．９９８２；肌肽回歸方程為：ｙ＝０．９４２４ｘ＋１７．９８４，?Ｒ２＝０．９９８０。??２５００－?１４．３?２６３??２０００－??置祕??Ｉ?鵝肌肽?肌肽??Ｉ?１０００－??＜?＼?＼?．?｜２９?－?２２?６２０??３－３１６０?＼Ｗ２６－１８?１０３?＾?Ａ??＾?Ｊ??〇．?６?７７５?ｉ＾ｉａｉ〇ｇｅｉ５２?ｉ?｜?？尸？戈３?，??？５ＱＱＪ｜＿－?■?－■－丨－．…■?■?．．?■?．?■．．．－—??０．０?５．０?１０．０?１５．０?２０．０?２５．０?３０．０??時?Ｍ?［ｍｉｎｉ??圖２．１肌肽及鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖??Ｆｉｇ．?２．１?Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，?ｃａｒｎｏｓｉｎｅ?ａｎｄ?ａｎｓｅｒｉｎ
【參考文獻(xiàn)】

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1 趙謀明;徐巨才;劉洋;趙容鐘;吳長平;蘇國萬;;秋刀魚制備黃嘌呤氧化酶抑制肽的工藝優(yōu)化[J];農(nóng)業(yè)工程學(xué)報;2015年14期

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本文編號：2851348