鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)是一種重要的益生菌,具有保持腸道微生態(tài)平衡,抑制有害細菌生長,消除過敏等生理功能,是目前被應用最為廣泛的乳酸菌之一。目前含有鼠李糖乳桿菌的制品種類繁多,但由于設備條件和技術水平千差萬別,導致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,許多產(chǎn)品存在活菌數(shù)不達標、種屬標識不符等質(zhì)量問題。因此建立快速、靈敏、精確的鼠李糖乳桿菌定量檢測方法對評價益生菌產(chǎn)品質(zhì)量、篩選理想菌株均具有重要意義。本論文圍繞鼠李糖乳桿菌的快速定量檢測,開展了以下幾方面的工作。(1)通過LGG菌毛亞基SpaA制備抗體偶聯(lián)免疫磁珠,通過辣根過氧化物酶放大信號,建立了一種免疫磁珠電化學傳感器檢測鼠李糖乳桿菌的方法。結果表明,在優(yōu)化的最佳抗體濃度、磁珠用量、免疫時間和溫度下建立了標準工作曲線,線性范圍為2.56×103-2.56×107CFU/mL,最低檢測限為22CFU/mL。該方法與干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌均無交叉反應,說明該傳感器具有良好的特異性。重復性實驗結果表明:5個樣本相對標準偏差(RSD)均小于5%重復性較好;穩(wěn)定性實驗結果表明,7 d后檢測發(fā)現(xiàn)電流值相對于初始值下降了 2.07%,14 d和21 d后分別下降了 5.07%和9.91%,整個檢測過程中表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。牛奶模擬樣品實驗中回收率在91.74%-108.67%,RSD在2.72%-5.16%之間,表明該傳感器能準確有效的檢測鼠李糖乳桿菌,且整個檢測過程不超過3 h。(2)以檸檬酸為碳源,乙二胺為表面鈍化劑利用微波法合成了藍色熒光的碳量子點,研究了其表面形態(tài)及熒光性質(zhì)。通過共價交聯(lián)的方法將合成的碳量子點標記SpaA抗體,特異性結合鼠李糖乳桿菌后通過熒光分光光度計測定其熒光強度來進行定量檢測。結果顯示,合成的碳量子點尺寸均一、分散性好,最佳激發(fā)波長為350nm,熒光強度不受K+,Na+的影響,在pH4-11之間熒光強度相對穩(wěn)定,適合用于微生物檢測。在優(yōu)化最佳檢測條件下建立了標準工作曲線,線性范圍為5×104-5×108CFU/mL,最低檢測限為103CFU/mL。同時也考慮了該方法的特異性并與菌落免疫印跡及流式細胞術檢測進行對比。結果表明,該方法與鼠李糖乳桿菌Bm01、LYO、BG均無交叉反應,鼠李糖乳桿菌LV108和CRL1505有一定的陽性信號但顯著低于LGG的熒光強度,與落免疫印跡實驗結果基本一致,表明了該方法具有良好的特異性。流式細胞術實驗中將碳量子點(CDs)與傳統(tǒng)染料(異硫氰酸熒光素)FITC進行對比,結果基本一致,但CDs具有耐光漂白、低細胞毒性、良好的生物相容性且成本低廉、操作簡便等特性,為微生物檢測提供了一種新穎綠色的工具。(3)為篩選廉價的鼠李糖乳桿菌特異性識別元件,以鼠李糖乳桿菌LGG為宿主菌,從糞便樣品中分離得到鼠李糖乳桿菌噬菌體,命名為LRPYZU021。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),LRPYZU021噬菌體形態(tài)為長尾噬菌體科,裂解譜試驗顯示噬菌體LRPYZU021只能裂解其宿主菌LGG,無法裂解其他5種鼠李糖乳桿菌,體現(xiàn)了該噬菌體極好的特異性。研究了噬菌體的基礎生物學特性。結果表明,噬菌體LRPYZU021在pH 6.0-11.0下穩(wěn)定性較好;在50℃及以下的溫度條件下,耐受性較好,對噬菌體進行最佳感染復數(shù)、一步生長曲線、抑菌能力的測定,為進一步利用鼠李糖乳桿菌噬菌體作為檢測特異性元件提供了新型材料。(4)將碳量子點標記鼠李糖乳桿菌噬菌體LRPYZU021,研究其標記效率以及標記好的噬菌體在存儲過程中的活性和熒光強度的變化。結果表明,碳量子點標記噬菌體后噬菌體存活率為82.42±4.72%,108PFU/mL濃度的噬菌體標記后有較強的熒光,體現(xiàn)了該方法良好的標記效率。儲存過程中噬菌體活性在5d內(nèi)無顯著降低,熒光強度在儲存過程中保持穩(wěn)定。將標記后的噬菌體特異性的吸附鼠李糖乳桿菌后通過熒光分光光度計測定其熒光強度以此來檢測鼠李糖乳桿菌,同時也考慮了該方法的特異性,并與流式細胞術檢測進行對比。結果表明,當細菌濃度為107CFU/mL以下時熒光強度不明顯,這可能由于CDs結合噬菌體效率低以及噬菌體誘導細胞裂解可能會阻礙量子點和噬菌體之間的相互作用;特異性表明該方法與Bm01、LYO、BG、LV108和CRL1505均無交叉反應,表明了該噬菌體相較抗體具有更好的特異性,為微生物檢測提供了一種新穎綠色,特異性極好的方法。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS207.3
【部分圖文】：

Ｓｉｍ等ｔ６５］首次將通過？￡０１５0＿純化的碳點引入細胞成像系統(tǒng)，應用于大腸桿菌共聚焦成像。逡逑Ｃａｏ等網(wǎng)用ＰＰＥＩ－ＥＩ修飾碳點使其具有雙光子熒光特性，并成功觀察到碳量子點進入ＭＣＦ－逡逑７細胞（圖１－１）內(nèi)部，說明碳量子點優(yōu)秀的細胞成像功能。逡逑ＩＨＩＭｉ逡逑圖Ｍ碳量子點用于ＭＣＦ－７細胞成像圖［８０］逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ邋ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＭＣＦ－７邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ邋Ｃ－Ｄｏｔｓ逡逑除了細胞成像外，ＣＤｓ由于其本身無毒的性質(zhì)也被大量的用于活體研宄來示蹤傳輸循逡逑環(huán)機理。Ｙａｎｇ等Ｍ將ＰＥＧ純化的碳量子點和摻雜硫化鋅的碳量子點注入小鼠體內(nèi)，如圖逡逑１－２實驗者將制備的碳點皮內(nèi)注入到老鼠體內(nèi)，隨著時間的推移ＣＤｓ慢慢遷移至腋下淋巴逡逑結，然后將組織切片檢測到了其在體內(nèi)的熒光。逡逑Ｈ邋■醒逡逑圖１－２小鼠腋下肌肉注射摻雜硫化鋅碳點后在淋巴管中徖移圖［８１］逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＺｎＳ－Ｄｏｔｓ邋ｉｍａｇｅｓ逡逑

信號進行實時的監(jiān)控和跟蹤藥物。Ｋｉｍ等用ＣＤｓ與金納米粒子表面的ＰＥＩ與ｐＤＮＡ交逡逑聯(lián)，交聯(lián)后碳點的熒光被ｐＤＮＡ猝滅。然后將交聯(lián)體導入細胞，在紫外光照射Ｆ釋放ｐＤＮＡ，逡逑碳點的熒光恢復，通過監(jiān)測釋放后的ｐＤＮＡ，達到藥物傳輸?shù)哪康模▓D１－３）。碳量子點不逡逑儀是出色的藥物載體，同時也是能量供體，此外不需要額外的熒光標記物，生物相容性好，逡逑能有效的將藥物運送到癌細胞中。逡逑ＣＤ－ＰＥＩ邐ｆ邐＾邋Ａ？ｔｏｃｉａｌ？ｏｎ邋＾邐＼邋＼逡逑＋邋＾ｅ＝２ｃ＾（邋－ＶＶ））逡逑－５邐ｃＤ＝ｅ＝ｒＮＡＸ＼逡逑Ａｕ－ＰＥｌ邐－邐Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ逡逑Ｃｅｌｌ邐＆邋＊邋＊邋＊邋＾．邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ逡逑４６５邋ｎｍ邋Ｒｅｃｏｖｅｒｙ邋0ｆ邋ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ逡逑圖ｌ－３ＣＤ－ＰＥＩ／Ａｕ－ＰＥＩ／ｐＤＮＡ組裝體用于基因傳送和細胞運輸實時監(jiān)測丨８３】逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋ＣＤ－ＰＥＩ／Ａｕ－ＰＥＩ／ｐＤＮＡ邋ａｓｓｅｍｂｌｙ邋ｆｏｒ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ逡逑１．４．２．３分析檢測逡逑碳量子點的熒光性質(zhì)受表面官能團的影響，能和多種金屬離子及分子相互作用。碳納逡逑米粒子探針的構建主要依靠其熒光猝滅或增強來實現(xiàn)，而電子轉移、動態(tài)碰撞及復合物或逡逑絡合物的形成都可能導致碳納米粒子的熒光發(fā)生猝滅或增強＠１。熒光碳納米粒子用于檢測逡逑金屬離子和小分子的優(yōu)點是用量少、反應靈敏、結果可靠、檢出限低、線性范圍寬

２．３．２免疫磁珠的表征逡逑２．３．２．１焚光表征逡逑如圖２－２所示，圖Ａ為偶聯(lián)ＳｐａＡ多抗磁珠，通過熒光顯微鏡觀察，藍色激發(fā)光下產(chǎn)逡逑生綠色熒光。圖Ｂ為對照組不產(chǎn)生綠色熒光。結果表明ＳｐａＡ多抗成功功能化于磁珠表面。逡逑ｍｍ逡逑圖２－２磁珠的熒光圖片逡逑Ｆｉｇ２－２邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＭＢｓ逡逑Ａ：邋ＭＢｓ－Ａｂ－ＳｐａＡ；邋Ｂ：邋ＭＢｓ逡逑２．３．２．２紅外表征逡逑如圖２－３所示，曲線ａ中，５８４邋ｃｍ－１處對應有吸收峰，是Ｆｅ－０鍵的特征峰。曲線ａ中逡逑１７００－１５７５邋ｃｍ－１、１４６０－１４２０邋ｃｍ－１有兩個特征峰，分別對應為Ｃ＝０、－０Ｈ的特征吸收峰，證逡逑明該磁珠為羧基化磁珠。曲線ｂ中，１６９０－１６３０ＣＨＴ１處對應有酰胺鍵的吸收峰存在，紅外光逡逑譜結果表明抗體成功偶聯(lián)于磁珠表面［９４］。逡逑

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2 杜元軍;邱慧玲;朱連勤;李佳s

本文編號：2811010