食品蛋白是無(wú)毒、營(yíng)養(yǎng)豐富、易消化、易獲取和農(nóng)業(yè)可持續(xù)的人體營(yíng)養(yǎng)攝入的關(guān)鍵蛋白質(zhì),每天由飲食攝取的食物蛋白質(zhì)對(duì)人體健康有著十分重要的作用,常見(jiàn)的食物蛋白主要有四種來(lái)源:(1)動(dòng)物來(lái)源(2)植物來(lái)源(3)大型藻類(lèi)來(lái)源(4)微生物來(lái)源。食品蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在食品加工(即熱加工和非熱加工)或儲(chǔ)存過(guò)程(即低溫保存)中可能發(fā)生變化,這對(duì)蛋白在體內(nèi)的生物利用率、代謝和營(yíng)養(yǎng)能力等都有一定的影響。因此,研究食品蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其在不同原料制備、加工或保存過(guò)程中的變化對(duì)更好利用食品蛋白是十分必要的。原子力顯微鏡作為一種重要的納米技術(shù)工具在食品蛋白研究中有著廣泛的應(yīng)用,其中高度成像是研究食品蛋白最常用的方法。本課題以食源性蛋白中的膠原蛋白、玉米醇溶蛋白為主要研究對(duì)象,運(yùn)用原子力顯微鏡從納米尺度到微米尺度對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)研究,具體開(kāi)展了如下工作:(1)采用醋酸法、熱水法和氫氧化鈉法三種提取方式從羅非魚(yú)皮中提取膠原蛋白,基于濕魚(yú)皮的質(zhì)量,三種提取方式膠原蛋白產(chǎn)量為:醋酸法(11.7%)熱水法(10.7%)氫氧化鈉法(8.5%),基于魚(yú)皮中初始膠原蛋白含量21.89g/100g蛋白產(chǎn)率分別為:醋酸法(53.4%)、熱水法(48.9%)、氫氧化鈉法(38.8%)。運(yùn)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)三種提取方式膠原進(jìn)行分子量的測(cè)定得:三種提取方式膠原蛋白分子量不同,且氫氧化鈉法提取的膠原分子大多是水解的;衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)結(jié)果顯示三種提取方式的膠原蛋白具有相似的分子結(jié)構(gòu)。(2)對(duì)醋酸法提取的羅非魚(yú)皮膠原蛋白(TSC)、I型牛肌腱(BFTC)和小鼠尾膠原蛋白(RTC)進(jìn)行多態(tài)性和穩(wěn)定性的研究,運(yùn)用SDS-PAGE電泳對(duì)同一濃度不同上樣量和不同濃度同一上樣量的三種膠原研究得出:濃度相同不同上樣量的三種膠原蛋白條帶強(qiáng)度有明顯差異,而對(duì)是否能夠跑出蛋白條帶無(wú)明顯影響;濃度不同上樣量相同時(shí),蛋白濃度的大小對(duì)是否能夠跑出蛋白條帶有顯著影響。運(yùn)用ATR-FTIR光譜對(duì)不同熱處理時(shí)間(0、7、14、21、28d)后波段范圍在1600-1700cm~(-1)三種膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析得BFTC二級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化不明顯,而RTC和TSC兩種膠原則隨時(shí)間變化明顯。運(yùn)用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)不同濃度下三種膠原蛋白的多態(tài)性進(jìn)行觀察,得納米結(jié)構(gòu)的形成具有一定的濃度依賴(lài)性。將濃度為0.4mg/mL的三種膠原蛋白液,在37℃條件下恒溫孵育不同時(shí)間(0、7、14、21和28d)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行研究得:BFTC在孵育過(guò)程中納米纖維轉(zhuǎn)化為左旋螺納米纖維,然后再轉(zhuǎn)化為納米顆粒;RTC納米結(jié)構(gòu)由原纖維、納米顆粒和無(wú)序聚集物轉(zhuǎn)化為納米顆粒和原纖維;TSC納米結(jié)構(gòu)的納米絲、納米顆粒和無(wú)序聚集物結(jié)構(gòu)則轉(zhuǎn)化為納米顆粒和原絲。(3)采用玉米醇溶蛋白進(jìn)行蛋白帶狀膜/纖維膜的制備,運(yùn)用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行成膜濃度的確定得,濃度為35%時(shí)能夠制備得到大量長(zhǎng)納米帶,且?guī)缀鯖](méi)有納米微粒的存在。因此,可用于納米帶/纖維膜的制備。運(yùn)用掃描電鏡(SEM)確定帶狀/纖維膜的成功制備,并用AFM對(duì)制備的膜進(jìn)行截面分析,進(jìn)一步確定蛋白膜的形狀。然后,將制備得到的帶狀/纖維膜用于Fe~(3+)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)載姜黃素玉米醇溶蛋白帶狀膜能夠更迅速,更高效的用于Fe~(3+)檢測(cè)實(shí)驗(yàn),且可用于飲用水中Fe~(3+)含量的檢測(cè),檢測(cè)溫度對(duì)Fe~(3+)的快速檢測(cè)有明顯影響,制備的這些納米帶狀膜具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。從而為蛋白帶狀膜的制備和其在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中的應(yīng)用提供了指導(dǎo),相信這也將在材料、環(huán)境和食品科學(xué)等科學(xué)和工程領(lǐng)域引起越來(lái)越多的關(guān)注。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS201.21
【部分圖文】：

圖 1-1 膠原酶降解膠原纖維的高速 AFM 原位成像(a)該過(guò)程的高度圖像序列。標(biāo)記 C 和 N的實(shí)線表示膠原纖維的極性。帶有線條的綠色圓圈代表膠原蛋白上的單個(gè)膠原酶分子。時(shí)間表示添加膠原酶后經(jīng)過(guò)的時(shí)間。Bar 為 50 nm; (b) (a)中突出區(qū)域的波動(dòng)曲線記錄儀，（c）對(duì)應(yīng)于（a，b）中標(biāo)記的纖維數(shù)量相對(duì)應(yīng)的單個(gè)最小纖維厚度的時(shí)間進(jìn)程，虛線框的（藍(lán)色）或（綠色）對(duì)應(yīng)與（a）中單個(gè)纖維上的膠原酶累積運(yùn)行長(zhǎng)度；（d）連續(xù)的高速 AFM 原位高度圖像，顯示了在膠原酶分子(圓形)作用下，最小原纖維(箭頭)的消失。Bar 為 20nm；掃描速率均為 0.3秒/幀；所有的 z-標(biāo)度都是 5nm。經(jīng)引用許可轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)（Watanabe Nakayama 等人，2016）Fig 1-1 In situ high speedAFM imaging of minimal collagen fibril degradation by collagenase.(a) Height image sequence of this process. The solid line with labels of C and N indicated collagenfibril polarity. Green circles with lines represent individual Collagenase molecules on collagen. Thetimes indicated the elapsed times after the addition of collagenase. Bar was 50 nm; (b) Kymographfor the region highlighted in (a). (c) Time courses of thicknesses of individual minimal fibrilscorresponding to the number-labed fibrils in (a,b), with accumulated collagenase run length onindividual fibrils within (blue) or including the outside (green) of the dashed-line box in (a). (d)Successive in situ high speedAFM height images of disappearance of a minimal fibril (arrowhead)

圖 1-3AFM 對(duì)蛋糕中麥醇溶蛋白和谷蛋白的觀察；（a）麥醇溶蛋白聚集體的 AFM 圖像；（b）麥醇溶蛋白聚集體的大小分布，在每個(gè)尺寸范圍內(nèi)，字母不同的組有顯著差異（P<0.05）；(c)傳統(tǒng)蛋糕和無(wú)蛋蛋糕中谷蛋白的多孔結(jié)構(gòu)（d）SPI + 0.1％XN（e）SPI + 1％MDG（f）SPI +1％SL（g）SPI + 0.1％XN + 1％MDG（h）SPI + 0.1％XN + 1％SL；SPI-大豆分離蛋白；XN-黃原膠；MDG-單甘油酯；SL-大豆卵磷脂。經(jīng)引用許可轉(zhuǎn)載（Lin,et al.2017b）（版權(quán)所有 2017愛(ài)思唯爾出版社）Fig 1.3 AFM observation of gliadin and glutenin in cakes. (a) AFM image of gliadin aggregates;(b) Size distribution of gliadin aggregates. Within each size range, groups with different letters aresignificantly different (P < 0.05). Porous structures of glutenin in (c) traditional cake and egglesscakes with (d) SPI + 0.1% XN, (e) SPI + 1% MDG, (f) SPI + 1% SL, (g) SPI + 0.1% XN + 1% MDG,(h) SPI + 0.1% XN + 1% SL. SPI  soy protein isolate; XN  xanthan gum; MDG  mono,diglycerides; SL  soy lecithin. Reprinted with permission of reference. (Copyright 2017 ElsevierPublisher)AFM 結(jié)果表明，蛋糕配方主要包含了麩朊聚集體，其直徑范圍在 100-200nm，

圖 1-4 純?nèi)榍宸蛛x蛋白膜(A, B)和乳清分離蛋白-玉米醇溶蛋白納米顆粒膜的 AFM 相位成像。經(jīng)引用許可轉(zhuǎn)載（版權(quán)所有 2016 愛(ài)思唯爾出版社）Fig 1-4AFM phase images of pure WPI film (A, B) and WPI-zein nanoparticle film (C, D).Adapted with permission of reference. (Copyright 2016 Elsevier Publisher)1.6.4 食品蛋白加工及保存效果研究了解不同加工和保存條件對(duì)食品蛋白的影響，對(duì)于開(kāi)發(fā)食品加工和保存的新技術(shù)、新方法具有重要意義。AFM 可用于加熱、冷凍干燥、高壓等不同物理處理?xiàng)l件下食品蛋白質(zhì)的觀察。為驗(yàn)證乳糖糖基化乳清分離蛋白膜的分散性，圖 5 是Liu 等人[28]在 pH3-7 條件下，運(yùn)用 AFM 輕敲模式對(duì)加熱前后乳糖糖化的乳清分離蛋白膜進(jìn)行的研究，高度圖像顯示了其分散的納米結(jié)構(gòu)，在 pH4-6 條件下加熱后的樣品比 pH3 和 pH7 條件下的樣品更粗、更大。該研究證明 AFM 納米成像可用于分析復(fù)雜加工條件對(duì)食品蛋白質(zhì)的影響。朱等運(yùn)用 AFM 研究了大豆分離蛋白（SPI）和乳清蛋白的熱誘導(dǎo)聚集，結(jié)果表明熱可以誘導(dǎo)納米粒子的形成，此外，熱誘導(dǎo)的大豆分離蛋白納米顆粒的粒徑比乳清蛋白大。運(yùn)用 AFM 觀察大豆分離蛋白（SPI）在液氮冷凍和冷凍干燥后的變化，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白膜表面光滑，空腔

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