發(fā)布時間：2022-11-12 11:21

　　2-酮基-L-古龍酸（2-keto-L-gulonic acid,2-KLG）是發(fā)酵法生產維生素C的直接前體。山梨糖脫氫酶（Sorbose dehydrogenase,SDH）是實現(xiàn)一菌一步發(fā)酵生產維生素C的關鍵節(jié)點之一。在前期研究中,本實驗獲得了一個來源于原始菌株氧化葡萄酸桿菌（Gluconobacter oxydans）WSH-004的FAD依賴的山梨糖脫氫酶,可以在不同的表達體系中實現(xiàn)活性表達。由于該山梨糖脫氫酶活性較低,如果需要利用其進行一菌一步發(fā)酵生產2-KLG,需要對其酶活進行大幅提升。本實驗將來源于G.oxydans WSH-004的山梨糖脫氫酶在大腸桿菌（Escherichia coli）中進行異源表達,發(fā)現(xiàn)該酶在E.coli中可以直接發(fā)酵催化L-山梨糖生成2-KLG。通過優(yōu)化啟動子、表達宿主篩選、優(yōu)化發(fā)酵溫度、敲除醛酮還原酶基因、敲除磷酸轉移酶系統(tǒng)（Phosphotransferase system,PTS）中的相關酶基因和通過易錯PCR對山梨糖脫氫酶進行隨機突變等方法,從而構建一個適合研究山梨糖脫氫酶的高通量篩選平臺。研究結果對代謝工程改造微生物實現(xiàn)一菌一步發(fā)酵生產... 

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 維生素C概述
    1.2 目前國內外維生素C的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 兩步發(fā)酵法產維生素C研究狀況
        1.2.2 一菌一步發(fā)酵法產維生素C研究狀況
    1.3 L-山梨糖到2-KLG代謝途徑中的其它相關研究進展
        1.3.1 2-KLG到L-艾杜糖酸的代謝途徑
        1.3.2 代謝途徑中L-山梨糖參與的作用
    1.4 立體依據(jù)與研究內容
        1.4.1 立體依據(jù)
        1.4.2 研究內容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要儀器
    2.2 分子生物學操作
        2.2.1 重組質粒的構建
        2.2.2 陽性轉化子的篩選與鑒定
        2.2.3 通過CRISPR-Cas9 技術敲除E.coli中的基因
        2.2.4 質粒的提取
        2.2.5 PCR產物的純化回收
        2.2.6 E.coli電轉感受態(tài)細胞的制備
        2.2.7 DNA片段的電轉化
        2.2.8 質粒消除
        2.2.9 易錯PCR
    2.3 培養(yǎng)方法
        2.3.1 細胞培養(yǎng)的方法
        2.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.3 共表達SDH和 SNDH的培養(yǎng)
        2.3.4 MMC培養(yǎng)
        2.3.5 進化菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化
        2.3.7 發(fā)酵罐分批發(fā)酵
    2.4 純化與分析方法
        2.4.1 酶的純化
        2.4.2 菌體濃度的測定
        2.4.3 2-KLG和L-山梨糖濃度的檢測
        2.4.4 高通量篩選方法
第三章 結果與討論
    3.1 基于分子改造提高2-酮基-L-古龍酸的產量
        3.1.1 不同啟動子對2-KLG產量的影響
        3.1.2 LC-MS鑒定目的產物與副產物
        3.1.3 篩選山梨糖脫氫酶表達宿主
        3.1.4 發(fā)酵溫度對2-KLG產量的影響
        3.1.5 在E.coli BL21(DE3)中共表達SDH與 SNDH
        3.1.6 搖瓶中產物生成及底消耗物的基本變化趨勢
        3.1.7 E.coli中醛酮還原酶基因的敲除
        3.1.8 敲除E.coli磷酸轉移酶系統(tǒng)中的基因
    3.2 基于微液滴馴化提高L-山梨糖的耐受性
        3.2.1 耐高濃度L-山梨糖菌株的第一輪進化
        3.2.2 耐高濃度L-山梨糖菌株的第二輪進化
        3.2.3 進化菌株在搖瓶中的生長狀況
        3.2.4 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.2.5 不同底物濃度對2-KLG產量的影響
        3.2.6 L-山梨糖和2-KLG對菌體生長的影響
        3.2.7 5L罐上高密度發(fā)酵2-KLG的產量
    3.3 基于易錯PCR篩選高產2-KLG的菌株
        3.3.1 2-KLG檢測范圍的確定
        3.3.2 多孔板高通量初篩體系
        3.3.3 搖瓶復篩
        3.3.4 山梨糖脫氫酶分段模塊研究
        3.3.5 基于DS模擬的定點突變
結論與展望
    主要結論
    展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3706274