丁二酮是一種常見的C4平臺化合物,在食品、化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)上生產(chǎn)丁二酮的方法包括天然產(chǎn)物提取法及化學(xué)合成法等,但二者均存在成本較高、污染嚴(yán)重等缺點。近年來微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酮受到越來越多的關(guān)注。本課題以產(chǎn)丁二酮的芽孢桿菌Bacillus sp.DL01-ΔalsD作為出發(fā)菌株,對該菌株進行代謝途徑改造以及發(fā)酵條件優(yōu)化,最大限度地提高該菌株中丁二酮的產(chǎn)量,為工業(yè)上利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酮提供理論依據(jù)。以B.sp.DL01-ΔalsD為出發(fā)菌株,構(gòu)建溫敏型質(zhì)粒pKS1-pta,利用無痕敲除技術(shù)將菌株乙酸代謝途徑上的關(guān)鍵酶磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶（PTA）的編碼基因pta敲除,獲得菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta。搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明,敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的乙酸產(chǎn)量明顯下降,丁二酮的產(chǎn)量顯著提高,達到3.67 g/L,是出發(fā)菌株B.sp.DL01-ΔalsD（2.82 g/L）的1.3倍�？寺碜杂贐.subtilis 168的乙酰乳酸合成酶基因,構(gòu)建過表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta,獲得重組B.sp.DL01-Δals... 

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻綜述
    1.1 丁二酮概述
        1.1.1 生物基四碳平臺化合物及其應(yīng)用
        1.1.2 丁二酮的性質(zhì)及用途
        1.1.3 丁二酮的制備方法
        1.1.4 丁二酮的檢測方法
    1.2 芽孢桿菌的概況
        1.2.1 芽孢桿菌的特性及用途
        1.2.2 芽孢桿菌的中心碳代謝途徑
    1.3 微生物法合成丁二酮的代謝途徑
        1.3.1 丁二酮的生產(chǎn)菌株
        1.3.2 丁二酮的代謝途徑
    1.4 提高丁二酮生物合成的策略
        1.4.1 優(yōu)化生產(chǎn)菌株
        1.4.2 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基
        1.4.3 優(yōu)化發(fā)酵條件
    1.5 數(shù)學(xué)建模在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用
        1.5.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法
        1.5.2 數(shù)學(xué)建模的應(yīng)用
    1.6 本課題研究的意義和內(nèi)容
        1.6.1 本課題研究的目的及意義
        1.6.2 本課題研究的內(nèi)容
2 阻斷芽孢桿菌B.sp.DL01-△alsD生成乙酸
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗儀器
        2.2.2 主要實驗材料
    2.3 實驗方法
        2.3.1 主要溶液配制
        2.3.2 菌株B.sp.DL01-△alsD的耐藥性實驗
        2.3.3 磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶編碼基因pta的擴增
        2.3.4 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.3.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞
        2.3.6 敲除質(zhì)粒pKS1-pta的構(gòu)建
        2.3.7 B.sp.DL01-△alsD感受態(tài)細胞的制備
        2.3.8 敲除質(zhì)粒pKS1-pta轉(zhuǎn)化到B.sp.DL01-△alsD感受態(tài)細胞
        2.3.9 基因pta的溫度誘導(dǎo)無標(biāo)記敲除
        2.3.10 菌體生長動力學(xué)曲線的繪制
        2.3.11 葡萄糖消耗動力學(xué)曲線的繪制
        2.3.12 發(fā)酵液中產(chǎn)物生成動力學(xué)曲線的繪制
        2.3.13 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.4 實驗結(jié)果與討論
        2.4.1 B.sp.DL01-ΔalsD的耐藥性分析
        2.4.2 pta基因上下游片段的擴增及鑒定
        2.4.3 敲除質(zhì)粒pKS1-pta的構(gòu)建
        2.4.4 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的篩選及驗證
        2.4.5 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的生長動力學(xué)曲線
        2.4.6 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的葡萄糖消耗動力學(xué)曲線
        2.4.7 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的發(fā)酵產(chǎn)物動力學(xué)曲線
    2.5 本章小結(jié)
3 強化芽孢桿菌B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta丁二酮的合成
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 主要實驗材料
    3.3 實驗方法
        3.3.1 主要溶液的配制
        3.3.2 乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS的擴增
        3.3.3 重組質(zhì)粒pHY300PLK-Pals-alsS168的構(gòu)建
        3.3.4 重組菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168 的構(gòu)建
        3.3.5 乙酰乳酸合成酶的活性測定
        3.3.6 菌體生長動力學(xué)曲線的繪制
        3.3.7 葡萄糖消耗動力學(xué)曲線的繪制
        3.3.8 發(fā)酵液中產(chǎn)物生成動力學(xué)曲線的繪制
        3.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.4 實驗結(jié)果與討論
        3.4.1 乙酰乳酸合成酶的篩選結(jié)果
        3.4.2 乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS168的擴增及鑒定結(jié)果
        3.4.3 重組菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168 的構(gòu)建
        3.4.4 乙酰乳酸合成酶的表達與活性分析
        3.4.5 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的生長動力學(xué)曲線
        3.4.6 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的葡萄糖消耗動力學(xué)曲線
        3.4.7 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的發(fā)酵產(chǎn)物動力學(xué)曲線
    3.5 本章小結(jié)
4 工程菌B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的發(fā)酵條件優(yōu)化
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗儀器
        4.2.2 主要實驗材料
    4.3 實驗方法
        4.3.1 主要溶液的配制
        4.3.2 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168培養(yǎng)方法
        4.3.3 菌體生長動力學(xué)曲線的繪制
        4.3.4 葡萄糖消耗動力學(xué)曲線的繪制
        4.3.5 發(fā)酵液中產(chǎn)物生成動力學(xué)曲線的繪制
        4.3.6 正交實驗
        4.3.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模
        4.3.8 遺傳算法對發(fā)酵條件的優(yōu)化
        4.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 發(fā)酵條件對丁二酮發(fā)酵的影響
        4.4.2 發(fā)酵條件的初步優(yōu)化
        4.4.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
        4.4.4 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定
        4.4.5 發(fā)酵罐水平恒底物補料對丁二酮發(fā)酵的影響
        4.4.6 丁二酮回收裝置的改進
    4.5 本章小結(jié)
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[4]2020年全球香精香料市場規(guī)模將達到300億美元[J]. 張紅梅.  中國洗滌用品工業(yè). 2017(12)
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3673076