皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase,CRL）被認(rèn)為是一種多才多藝、很有前景的生物催化劑,在制藥、食品、化妝品、能源等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。CRL商品酶主要由野生型菌株ATCC 14830和Type VII生產(chǎn),目前已知由8種同工酶組成,其中CRL1具有最高的表達(dá)量和酶活力。不同商品酶之間由于同工酶的成分和比例不同,在底物選擇性和催化效率上表現(xiàn)出顯著差異。分離或生產(chǎn)單一的皺褶假絲酵母脂肪酶,尤其是CRL1,對(duì)開展進(jìn)一步研究工作具有重要意義。畢赤酵母是目前應(yīng)用最為廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),有利于外源蛋白的高效表達(dá)和工業(yè)生產(chǎn)。畢赤酵母表面展示體系是一種經(jīng)濟(jì)有效的酶固定化手段,可以有效提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用效果、降低生產(chǎn)成本。本文以畢赤酵母為宿主細(xì)胞,分別構(gòu)建皺褶假絲酵母脂肪酶CRL1的高效分泌表達(dá)和高效表面展示重組菌株,發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶催化劑。在此基礎(chǔ)上,研究了兩種類型重組CRL1的酶學(xué)性質(zhì),然后建立并優(yōu)化了無溶劑體系中CRL1催化合成維生素E醋酸酯的綠色制備工藝體系,為其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:（1）將經(jīng)密碼子優(yōu)化的CRL1基因克隆... 

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 脂肪酶簡(jiǎn)介
        1.1.1 脂肪酶的來源
        1.1.2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.1.3 脂肪酶的應(yīng)用
    1.2 皺褶假絲酵母脂肪酶
        1.2.1 皺褶假絲酵母脂肪酶簡(jiǎn)介
        1.2.2 皺褶假絲酵母脂肪酶的克隆表達(dá)
        1.2.3 皺褶假絲酵母脂肪酶的生化結(jié)構(gòu)
        1.2.4 皺褶假絲酵母脂肪酶的應(yīng)用
    1.3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)
        1.3.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)
        1.3.2 提高外源蛋白表達(dá)的策略
        1.3.3 畢赤酵母表面展示系統(tǒng)
    1.4 維生素E衍生物
        1.4.1 維生素E衍生物簡(jiǎn)介
        1.4.2 酶法合成維生素E醋酸酯
    1.5 本課題的研究意義和研究?jī)?nèi)容
        1.5.1 本課題的研究意義
        1.5.2 本課題的研究?jī)?nèi)容
第二章 皺褶假絲酵母脂肪酶CRL1在畢赤酵母的高效分泌表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析
    2.1 引言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 主要儀器
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 菌株和質(zhì)粒
        2.2.4 培養(yǎng)基的配置
        2.2.5 溶液的配置
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 分泌型重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 分泌型重組菌株的構(gòu)建和篩選
        2.3.3 蛋白純化
        2.3.4 酶學(xué)性質(zhì)分析
        2.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 分泌型重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.2 分泌型重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建和篩選
        2.4.3 啟動(dòng)子和信號(hào)肽改造對(duì)分泌表達(dá)水平的影響
        2.4.4 分泌型重組CRL1的蛋白純化
        2.4.5 分泌型重組CRL1的酶學(xué)性質(zhì)
        2.4.6 高表達(dá)分泌型重組株的3L補(bǔ)料分批發(fā)酵
    2.5 本章小結(jié)
第三章 皺褶假絲酵母脂肪酶CRL1在畢赤酵母的高效表面展示及酶學(xué)性質(zhì)分析
    3.1 引言
    3.2 材料與儀器
        3.2.1 主要儀器
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 菌株、質(zhì)粒和引物
        3.2.4 培養(yǎng)基的配置
        3.2.5 溶液的配置
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 表面展示重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 表面展示重組菌株的構(gòu)建和篩選
        3.3.3 多拷貝重組菌株的構(gòu)建和篩選
        3.3.4 重組菌株的基因拷貝數(shù)鑒定
        3.3.5 畢赤酵母重組菌株的胞內(nèi)蛋白提取
        3.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析
        3.3.7 酵母細(xì)胞載酶量測(cè)定
        3.3.8 表面展示CRL1酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
        3.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建和篩選
        3.4.2 多拷貝表面展示重組菌株的構(gòu)建和篩選
        3.4.3 多拷貝表面展示重組菌株過表達(dá)HAC1轉(zhuǎn)錄因子
        3.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析
        3.4.5 表面展示重組菌株展示效率分析
        3.4.6 表面展示CRL1的酶學(xué)性質(zhì)分析
        3.4.7 高表達(dá)表面展示重組菌株的3L補(bǔ)料分批發(fā)酵
    3.5 本章小結(jié)
第四章 皺褶假絲酵母脂肪酶CRL1在無溶劑體系中催化合成維生素E醋酸酯
    4.1 引言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 主要試劑
        4.2.2 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 硝酸法鑒定D-α-生育酚
        4.3.2 脂肪酶催化劑的制備
        4.3.3 催化反應(yīng)體系
        4.3.4 催化反應(yīng)條件優(yōu)化
        4.3.5 體系放大及產(chǎn)物純化
        4.3.6 HPLC-UV定量檢測(cè)方法
        4.3.7 其他分離檢測(cè)方法
        4.3.8 產(chǎn)物純化
        4.3.9 產(chǎn)物表征
        4.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 脂肪酶和�；w篩選
        4.4.2 反應(yīng)條件優(yōu)化
        4.4.3 產(chǎn)物分離純化
        4.4.5 產(chǎn)物表征
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
    結(jié)論
    創(chuàng)新點(diǎn)
    展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號(hào)：3657238