少動(dòng)鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas elodea JLJ）發(fā)酵產(chǎn)生的結(jié)冷膠（gellan gum）是一種高分子線性陰離子型胞外莢膜多糖。其具有良好的耐熱性、耐酸堿性、無(wú)毒無(wú)害等性能,廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域。在結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中,隨著結(jié)冷膠的積累,發(fā)酵液會(huì)變得越發(fā)粘稠,因此其發(fā)酵過(guò)程中的溶氧供需矛盾一直是一個(gè)亟待解決的嚴(yán)峻問(wèn)題。本研究擬采用CRISPR/Cas9技術(shù)將透明顫菌血紅蛋白（vgb）基因敲入少動(dòng)鞘氨醇單胞菌細(xì)胞內(nèi)改造其代謝網(wǎng)絡(luò),從而提高菌株攝取和利用氧的能力,解決結(jié)冷膠發(fā)酵過(guò)程中氧的供需矛盾,有效提高結(jié)冷膠產(chǎn)量;對(duì)重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行改造,最終使得結(jié)冷膠的產(chǎn)量得到顯著提高。主要研究結(jié)果為:（1）通過(guò)PCR法擴(kuò)增獲得乙�；D(zhuǎn)移酶基因（nat）片段,確定菌株JLJ基因組中存在nat基因,選定其為靶位點(diǎn)。（2）通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)菌株JLJ進(jìn)行改造,將透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）敲入基因組中,并將nat基因敲除,獲得重組菌株JLJ-vgb。PCR、SDS-PAGE以及CO差光譜分析均表明vgb基因已成功敲入菌株JLJ基因組中,并成功表達(dá)有活性的血紅蛋... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 結(jié)冷膠研究進(jìn)展
        1.1 少動(dòng)鞘氨醇單胞菌
        1.2 結(jié)冷膠
            1.2.1 概述
            1.2.2 結(jié)冷膠的結(jié)構(gòu)
            1.2.3 結(jié)冷膠的理化性質(zhì)
            1.2.4 結(jié)冷膠的體內(nèi)合成過(guò)程
            1.2.5 結(jié)冷膠發(fā)酵的研究
            1.2.6 結(jié)冷膠的應(yīng)用
        1.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的概述
            1.3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌中的工作原理
        1.4 透明顫菌血紅蛋白
            1.4.1 概述
            1.4.2 透明顫菌血紅蛋白（VHb）的結(jié)構(gòu)
        1.5 乙酰基轉(zhuǎn)移酶（nat）基因
        1.6 本文研究意義及內(nèi)容
第二章 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株代謝工程改造
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2 主要儀器設(shè)備
        2.3 主要試劑
        2.4 培養(yǎng)基
        2.5 主要溶液的配制
    3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟
        3.1 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)
        3.2 透明顫菌的培養(yǎng)
        3.3 引物設(shè)計(jì)
        3.4 菌株基因組DNA的提取
        3.5 乙�；D(zhuǎn)移酶基因（nat）的克隆
        3.6 克隆基因片段的膠回收
        3.7 感受態(tài)大腸桿菌的制備
        3.8 p MD19-T-nat的構(gòu)建
        3.9 p EASY-Blunt Zero-nvn克隆載體的構(gòu)建
            3.9.1 乙�；D(zhuǎn)移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆
            3.9.2 透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）的克隆
            3.9.3 一步重疊PCR
            3.9.4 克隆載體p EASY-Blunt Zero-nvn的構(gòu)建
        3.10 表達(dá)載體p Target F-New-vgb的構(gòu)建
        3.11 少動(dòng)鞘氨醇單胞菌JLJ感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.12 電轉(zhuǎn)化少動(dòng)鞘氨醇單胞菌JLJ
        3.13 重組菌株JLJ-vgb中質(zhì)粒的消除
        3.14 重組菌株JLJ-vgb的鑒定
            3.14.1 PCR鑒定
            3.14.2 SDS-PAGE分析
            3.14.3 VHb活性的測(cè)定——CO差光譜法
            3.14.4 重組菌株的傳代培養(yǎng)
            3.14.5 重組菌株穩(wěn)定性檢測(cè)
        3.15 結(jié)冷膠產(chǎn)量的測(cè)定
        3.16 發(fā)酵培養(yǎng)基中生物量的測(cè)定
        3.17 重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化
            3.17.1 單因素實(shí)驗(yàn)
            3.17.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
    4 結(jié)果與分析
        4.1 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株的改造
            4.1.1 基因敲入靶位點(diǎn)的克隆
            4.1.2 pEASY-Blunt Zero-nvn克隆載體的構(gòu)建
                4.1.2.1 乙�；D(zhuǎn)移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆
                4.1.2.2 vgb基因的克隆
                4.1.2.3 一步重疊PCR
            4.1.3 表達(dá)載體p arget F-New-vgb的構(gòu)建
            4.1.4 重組菌株JLJ-vgb的獲得及鑒定
                4.1.4.1 PCR鑒定
                4.1.4.2 SDS-PAGE分析
                4.1.4.3 VHb蛋白活性的檢測(cè)
                4.1.4.4 重組菌株JLJ-vgb穩(wěn)定性分析
        4.2 重組菌株JLJ-vgb發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化
            4.2.1 碳源種類(lèi)及濃度的優(yōu)化
            4.2.2 氮源種類(lèi)及濃度的優(yōu)化
            4.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化
            4.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
                4.2.4.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及模型建立
                4.2.4.2 模型 3D及等高線分析
                4.2.4.3 模型的驗(yàn)證
    5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄一 乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因序列
附錄二 pEASY-Blunt Zero-nvn部分基因序列
附錄三 pTarget F-New反向PCR部分基因序列
附錄四 pTarget F-New-vgb表達(dá)載體部分基因序列
附錄五 重組菌株JLJ-vgb vgb基因序列


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]12種食品膠的乳化性能比較研究[J]. 鄭梅霞,朱育菁,陳崢,劉欣,劉波.  食品工業(yè). 2018(04)
[2]透明顫菌血紅蛋白基因在酶工程中的應(yīng)用[J]. 王興吉,佟新偉,劉文龍,張杰.  食品與發(fā)酵科技. 2017(06)
[3]結(jié)冷膠發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 趙體金.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2016(15)
[4]透明顫菌血紅蛋白的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 陳云美,徐海洋,王世明.  生物技術(shù)通報(bào). 2015(02)
[5]結(jié)冷膠研究進(jìn)展[J]. 文春溪,劉鐘棟.  中國(guó)食品添加劑. 2014(01)
[6]微生物多糖結(jié)冷膠的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化[J]. 李傳寶,黃金,何軍邀,王普.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2013(04)
[7]初始碳源及補(bǔ)加碳源對(duì)結(jié)冷膠分批發(fā)酵的影響[J]. 陳平紅,楊生玉.  河南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2013(01)
[8]高�；Y(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究[J]. 楊冬月,朱萌萌,李龍偉,王念祥,陸啟明.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2012(09)
[9]利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和結(jié)冷膠提高魚(yú)丸凝膠強(qiáng)度的研究[J]. 蘇德福,林向陽(yáng),吳求林,陳興才.  農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊). 2010(01)
[10]凝膠多糖制備及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 葉鋒,周玉杰,張建安,張富春.  現(xiàn)代化工. 2007(S2)

博士論文
[1]結(jié)冷膠的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化及其在食品中的應(yīng)用研究[D]. 朱桂蘭.江南大學(xué) 2015

碩士論文
[1]結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵優(yōu)化[D]. 徐力.浙江工業(yè)大學(xué) 2015
[2]結(jié)冷膠發(fā)酵工藝的研究[D]. 王歆童.河南大學(xué) 2011
[3]高�；Y(jié)冷膠的特性及其對(duì)果粒酸性乳飲料體系的影響[D]. 盧晶.浙江工商大學(xué) 2011
[4]人乳鐵蛋白、胸腺肽融合基因在畢赤酵母與生菜中表達(dá)的研究[D]. 孟志剛.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005
[5]堿性蛋白酶的發(fā)酵與酶學(xué)性質(zhì)的研究[D]. 苑琳.天津科技大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3639040