【摘要】：氨基葡萄糖(GlcN)是一種天然小分子單糖,是當(dāng)今世界上認(rèn)可度較高的一種有效治療骨關(guān)節(jié)疾病的藥品、當(dāng)作為膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑時(shí)能有效的減緩骨關(guān)節(jié)炎癥。可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、農(nóng)業(yè)及化妝品等領(lǐng)域。GlcN主要由甲殼素水解法和微生物發(fā)酵法制得,據(jù)報(bào)道,甲殼素水解法存在原材料受限,環(huán)境污染嚴(yán)重等問題,微生物發(fā)酵法存在產(chǎn)量低,菌體對GlcN不耐受等缺點(diǎn)。本研究利用幾丁二糖脫乙酰酶(Dac)通過環(huán)境友好的生物催化法將底物GlcNAc高效水解為GlcN。首先,將來源于極端嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)的幾丁二糖脫乙酰酶基因(Dac)在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌成功實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá),利用催化活力更高的重組枯草芽孢桿菌B.subtili-Dac全細(xì)胞催化合成GlcN。同時(shí),將Dac在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行高效分泌表達(dá),經(jīng)過信號肽篩選及啟動(dòng)子替換,獲得最優(yōu)信號肽YncM和啟動(dòng)子P43,胞外酶活力達(dá)到18.6 U?mL~(-1)。在其構(gòu)建質(zhì)粒過程中獲得了5’非翻譯區(qū)(5’UTR)突變的質(zhì)粒,構(gòu)建出重組菌株BS-NMKmut-yncM-Dac,胞外酶活提高至1548.7 U?mL~(-1)。在此基礎(chǔ)上,將編號為C4的N端編碼序列(NCS)融合在Dac基因的N端,構(gòu)建出重組菌株BS-NMKmut-C4-yncM-Dac,胞外酶活提高至2015.3 U?mL~(-1)。其次,通過定點(diǎn)飽和突變及高通量篩選技術(shù)獲得催化活力明顯提高的Dac突變體R157T,K_m值從原來的6.75 mM降低為5.15 mM,V_(max)值從4.94μM?s~(-1)提高到7.56μM?s~(-1),比酶活從2047.3 U?mg~(-1)提高到3112.2 U?mg~(-1)。最后,對B.subtili-Dac/R157T進(jìn)行全細(xì)胞催化條件優(yōu)化,最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為:底物GlcNAc終濃度50 g?L~(-1),細(xì)胞添加量18.6 g?L~(-1),轉(zhuǎn)化體系pH 7.5,溫度40oC,催化時(shí)間3 h。在3-L發(fā)酵罐中GlcN產(chǎn)量最高達(dá)35.3 g?L~(-1),摩爾轉(zhuǎn)化率為86.8%。利用BS-NMKmut-C4-yncM-Dac/R157T發(fā)酵上清液進(jìn)行酶法脫乙酰合成GlcN的條件優(yōu)化,最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件:底物GlcNAc終濃度50 g?L~(-1),酶終濃度6000 U?mg~(-1),溫度40oC,催化時(shí)間25 min。在1-L發(fā)酵罐中GlcN的產(chǎn)量達(dá)到35.4 g?L~(-1),轉(zhuǎn)化率為87.4%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925;TQ281
【圖文】：

易溶于水，無特殊氣衍生物或胞壁酸的形式存室溫環(huán)境下，其可在 pH降[1]。目前市場上 GlcN式存在，在室溫下可穩(wěn)定用單糖，是在人體中含量最骨的重要組成成分[4]。大骨細(xì)胞的生長促進(jìn)軟骨的圖 1-1 GlcN 的結(jié)構(gòu)式Fig. 1-1 Structure of GlcN

酶的來源與種類（Dac）屬于糖類酯酶，來源于熱球菌將其水解為 GlcN。ShouheiMine[40]等途徑，推斷在熱球菌屬中均存在相類在同源蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，在熱球菌屬 Pyrococcusabyssi 等菌株中均存在 Da氨基酸序列進(jìn)行相似性分析；根據(jù) Py框序列（ORF），以在 NCBI 上預(yù)測的這些細(xì)菌中的 Dac 序列的相似度如下uschitonophagus 相似度為 80%；Pyroco Tanaka[37]等人通過對來源于 T. kodakar酶學(xué)性質(zhì)分析，研究結(jié)果表明 Dac 的最波[39, 41]等人對來源于 P. horikoshii 的幾圖 1-2 Dac 催化 GlcNAc2流程圖Fig. 1-2 The process of Dac catalyze GlcNAc2

需利用強(qiáng)堿浸泡，并且需要多種酶同時(shí)參與，步驟復(fù)雜在來源及應(yīng)用受限、生產(chǎn)效率低等問題。而利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大降低了強(qiáng)酸強(qiáng)堿的使用量，但發(fā)酵液中無法實(shí)現(xiàn)高濃度的積累，放在 GlcN 的前體物質(zhì) GlcNAc 上，可實(shí)現(xiàn)在發(fā)酵液中大量積累 G將 GlcNAc 水解為 GlcN，但該過程需利用鹽酸進(jìn)行加熱反應(yīng)，會(huì)有，依然會(huì)造成環(huán)境污染及設(shè)備腐蝕等問題。因此，為了解決酸法水找到一種安全的方法來代替酸法水解，利用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn) GlcN，即cNAc 經(jīng)脫氨基作用轉(zhuǎn)化為 GlcN，高效地且以環(huán)境友好型的方法生產(chǎn)化學(xué)水解法、微生物發(fā)酵法和多酶復(fù)合催化法存在的步驟復(fù)雜、反染嚴(yán)重、生產(chǎn)設(shè)備易腐蝕和制備周期長的問題。以 GlcNAc 為底物酶催化，實(shí)現(xiàn)一步生產(chǎn) GlcN，底物來源充足，不受原材料限制，制染小，且反應(yīng)專一性高，體系中雜質(zhì)少易于下游分離純化，生產(chǎn)成源的脫乙酰酶，來源于極端嗜熱古菌（PyrococcushorikoshiiOT3）c 為底物進(jìn)行高效的催化水解反應(yīng)生成 GlcN，因此選擇以 GlcNAc劑采用生物催化法生產(chǎn) GlcN。本研究中的脫乙酰反應(yīng)過程如圖 1-

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2 李靜;趙祥穎;劉建軍;;微生物幾丁質(zhì)酶及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[J];食品工程;2006年01期

3 張威;張明;白震;陳盈;閆穎;張旭東;;土壤中幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展[J];土壤通報(bào);2007年03期

4 王宏煒;袁琳;;弧菌幾丁質(zhì)降解代謝及調(diào)控機(jī)理的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2007年05期

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本文編號：2800716