【摘要】：D-塔格糖(D-tagatose)是一種具有降低血糖、改善腸道菌群、促進血液健康等功能的新型甜味劑,廣泛應(yīng)用于美容、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。植物乳桿菌WU14(Lactobacillus plantarum WU14,L.plantarum WU14)是一株從酸菜中分離出的乳酸菌,可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化D-塔格糖的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-Arabinose Isomerase,L-AI)。本文在L.plantarum WU14產(chǎn)L-AI的發(fā)酵工藝優(yōu)化基礎(chǔ)上,建立數(shù)學模型,對D-塔格糖進行分離純化,并利用生物信息學預(yù)測影響L-AI熱穩(wěn)定性的氨基酸位點,進行原核表達。研究結(jié)果如下:1、以L.plantarum WU14的生物量及L-AI酶活為指標,利用單因素與響應(yīng)面實驗對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖4.35 g、L-阿拉伯糖2.71 g、酵母浸粉17.6 g、大豆蛋白胨17.6 g、無水乙酸鈉10 g、MgSO_4·7H_2O 0.4 g、MnSO_4·2H_2O0.05 g、K_2HPO_4 0.4 g,培養(yǎng)條件:發(fā)酵初始pH值6.24、發(fā)酵溫度28.6℃、接種量2%、發(fā)酵20 h,L.plantarum WU14的菌體量比優(yōu)化前提高了近48%,L-AI酶活達42.23U/mL,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率達到69.6%。2、分析L.plantarum WU14發(fā)酵過程,發(fā)現(xiàn)L.plantarum WU14的生物量與L-AI的形成呈部分偶聯(lián)型關(guān)系。利用Logistic方程和Boltzmann模型對L.plantarum WU14生物量、L-AI酶活等實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合,建立L.plantarum WU14生長動力學、葡萄糖消耗動力學及L-AI生成動力學模型,其擬合度分別為0.99157、0.99443、0.98461,能較好的反映L.plantarum WU14發(fā)酵過程中D-塔格糖生物轉(zhuǎn)化的變化規(guī)律。3、通過離心、脫色、除蛋白、脫鹽、鈣樹脂分離D-半乳糖、冷凍干燥等方法將D-塔格糖從發(fā)酵液中分離出來,并利用傅里葉紅外光譜分析鑒定。4、反應(yīng)體系中加入硼酸鹽緩沖液,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化溫度為60℃、反應(yīng)pH為7.17,粗酶液的添加量與D-半乳糖體積比為5:1、硼酸鹽與D-半乳糖的體積比為2:1時,轉(zhuǎn)化24 h后,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率達到68%,與未加硼酸鹽轉(zhuǎn)化體系相比提高12%。5、為提高L.plantarum WU14的L-AI熱穩(wěn)定性,對L-AI進行分子改良。經(jīng)同源建模,找到3個疑似位點,將其自由組合,以E.coil BL21(DE)為表達宿主菌,構(gòu)建7個突變體即G242P、G371P、G372P、G242P/G371P、G242P/G372P、G372P/G371P、G242P/G371P/G372P。進行酶學性質(zhì)測定,發(fā)現(xiàn)突變型與野生型的最適溫度及最適pH未發(fā)生變化。突變型的熱穩(wěn)定性都有所提高,其中三點突變(G242P/G371P/G372P)最為明顯,70℃處理90 min后,仍具有53.59%的剩余酶活,野生型僅剩11.72%。說明在L-AI非催化中心區(qū)域引入脯氨酸,對提高L-AI的熱穩(wěn)定性有積極作用,為L-AI工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925

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