【摘要】：亮氨酸脫氫酶(LeuDH,EC 1.4.1.9)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)并參與多種支鏈氨基酸合成的酶。能可逆催化L-型氨基酸氧化脫氨基合成α-酮酸。利用亮氨酸脫氫酶還原氨化α-酮酸合成非蛋白源氨基酸得到了廣泛的研究和開發(fā),如L-叔亮氨酸和L-正纈氨酸的合成等;而利用亮氨酸脫氫酶氧化脫氨基L-氨基酸合成α-酮酸的研究較少,其產(chǎn)物α-酮酸可以用于飼料、食品添加劑、藥物和化學(xué)品的合成過程,并在人類健康方面具有重要的作用。本研究以來源于短小芽孢桿(Exiguobacterium siricum255-15)亮氨酸脫氫酶(簡寫為EDH)為研究材料,通過對(duì)EDH的定向進(jìn)化,篩選高酶活的EDH突變株,應(yīng)用于亮氨酸脫氫酶生物合成α-酮酸應(yīng)用。本論文的主要研究內(nèi)容如下:1、構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EDH,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,得到高效表達(dá)的重組菌株BL21(pET28a-EDH),對(duì)目標(biāo)蛋白純化后,對(duì)EDH酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果表明對(duì)于轉(zhuǎn)氨和脫氨反應(yīng),亮氨酸脫氫酶催化反應(yīng)的最適pH同為9.5、最適溫度分別為45℃和50℃,且在還原胺化反應(yīng)方向上,具有更好的pH穩(wěn)定性。分別對(duì)亮氨酸脫氫酶的轉(zhuǎn)氨和脫氨反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定,脫氨反應(yīng)中亮氨酸脫氫酶對(duì)NAD~+和L-亮氨酸的Km值為0.656和0.762mM,說明其親和性良好。而轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中亮氨酸脫氫酶對(duì)NADH及TMP(三甲基丙酮酸)Vmax較大,分別為333.3和55.6 μmol/(min·mg),說明其在催化TMP合成L-叔亮氨酸方向具有巨大潛力。通過對(duì)亮氨酸脫氫酶的催化底物譜測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)亮氨酸脫氫酶對(duì)L-型氨基酸就有較為廣泛的底物譜,但對(duì)D-型氨基酸沒有催化活性,且D-型氨基酸會(huì)抑制其活性。當(dāng)在亮氨酸脫氫酶催化L-亮氨酸時(shí),添加同等濃度的D-亮氨酸,其酶活性降低近50%。2、建立了一個(gè)簡單可行的適用于亮氨酸脫氫酶的高通量篩選方法。即在誘導(dǎo)突變菌體表達(dá)酶蛋白的同時(shí),在培養(yǎng)基中添加甘氨酸和tritonx-100,使重組細(xì)胞快速裂解釋放目標(biāo)蛋白,便于突變酶的活性檢測和篩選,通過本實(shí)驗(yàn)建立的篩選方法對(duì)1055個(gè)EDH突變子進(jìn)行篩選,篩選到一株EDH突變子K172R,對(duì)L-亮氨酸的催化活性為14.15 U/mg,較野生型酶活性提高了 45.9%,對(duì)底物L(fēng)-亮氨酸和輔酶NAD~+的與野生型的Km值分別為0.313和0.5 mM,與野生型酶相比具有更高的親和性。將突變子K172R應(yīng)用于催化L-亮氨酸脫氨基反應(yīng)合成α-酮異己酸反應(yīng),構(gòu)建了 EDH偶聯(lián)乳酸脫氫酶(LDH)作為輔酶再生循環(huán)的雙酶體系用于α-酮異己酸的合成,經(jīng)過初步催化實(shí)驗(yàn),反應(yīng)24h后,突變子K172R催化L-亮氨酸得到產(chǎn)物α-酮異己酸的產(chǎn)量為7.22 mM,較野生型EDH的催化合成產(chǎn)量提高了 29.02%。3、構(gòu)建EDH和葡萄糖脫氫酶(GDH)雙酶偶聯(lián)反應(yīng)體系,并對(duì)催化合成L-叔亮氨酸反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的底物TMP和葡萄糖的摩爾比為1:2,最佳的反應(yīng)溫度和pH分別為30℃和pH 10.0。在此條件下反應(yīng)7h,底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%,產(chǎn)物L(fēng)-叔亮氨酸濃度達(dá)到100 mM,其光學(xué)純度大于99%(e.e.%)。與雙菌體系相比,雙質(zhì)粒系統(tǒng)使用更低的菌體濃度,達(dá)到更高的反應(yīng)效率,生產(chǎn)過程更為簡單。
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q814;TQ925
【圖文】：

（ＤＡＰＤＨ）g巨夠還原l#化ａ－嗣酸還原l#化得到Ｄ－氛基酸，２，６－二氨基庚二酸脫逡逑氫酶是微生物中生產(chǎn)合成Ｌ－賴氨酸的代謝途徑中關(guān)鍵酶［４８］，該酶能夠?qū)ⅲ茫剑斑�逡逑原氨化為Ｃ－ＮＨ２，其中心碳原子的構(gòu)型為Ｄ型，如圖１．４所示。而且文獻(xiàn)報(bào)道的逡逑ＤＡＰＤＨ的來源只有少數(shù)幾種，是分別是來源于谷氨酸棒狀桿＠１，嗜熱脂肪芽孢逡逑桿菌邋ＵｒｅｉｂａｃｉＨｕｓ邋ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒｉｃｕｓｌ’，嗜熱共生菌辦灥逡逑／／７r饋貳浚凡蓿保擔(dān)保蕁Ｈ歡模粒校模染哂蟹淺Ｑ細(xì)竦牡孜鍥�、较低的催化活性簽沉x希危粒模校ǎ齲└敢覽敵停拗屏似溆τ�，用{糠盅芯空攵雜冢�，６－二氨基庚二酸蛠嗏辶x廈傅牡孜鍥準(zhǔn)案謀涓附岷咸匭緣畝ㄏ蚪�，取得轿r玫男Ч�，扩大了茰Z孜鍥族義蝦透附岷咸匭浴ｅ義希

本文編號(hào)：2737132