【摘要】：單寧酶(EC 3.1.1.20),全稱單寧�；饷�(Tannin Acyl Hydrolase),是一類能夠水解沒食子單寧分子中的酯鍵、縮酚鍵和糖苷鍵,生成葡糖糖和沒食子酸及其他醇類化合物。另外,單寧酶能水解表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG),還可以催化沒食子酸丙酯的合成,它在食品、化工、飼料、醫(yī)藥等領域都有重要應用。我們發(fā)現(xiàn)茶樹內(nèi)生真菌菌核青霉AHAUCHA 001具有產(chǎn)生單寧酶的能力,我們對該菌的產(chǎn)酶條件進行了研究,并對該菌所產(chǎn)單寧酶進行了分離純化,研究了相關的酶學性質(zhì),研究結(jié)果報告如下。對菌核青霉AHAUCHA 001固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶工藝參數(shù)進行了研究:培養(yǎng)時間72 h,鹽溶液pH6.0,培養(yǎng)溫度28℃,五倍子粉含量40%(w/w),額外添加氯化銨2%(w/v),不添加額外碳源,接種量2 mL(4×10~7個孢子/mL),經(jīng)過優(yōu)化后單寧酶酶活達到131.01 U/gds,是優(yōu)化前的6.26倍。菌核青霉AHAUCHA 001菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶參數(shù)優(yōu)化:培養(yǎng)時間96 h,鹽溶液pH6.0,培養(yǎng)溫度31℃,單寧酸含量1%(w/v),0.4%(w/v)的硝酸鈉作為氮源,可溶性淀粉2%(w/v)作為碳源,轉(zhuǎn)速180 r/min,經(jīng)過優(yōu)化后單寧酶酶活為42.11U/mL,是優(yōu)化前的12.20倍。采用硫酸銨沉淀法、分子篩層析法(葡聚糖凝膠G-100)、離子交換層析法(DEAE-纖維素)部分純化單寧酶,最終的酶活力回收率為16.84%,純化倍數(shù)4.77倍。實驗單寧酶由572個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為62.396 KDa,預測等電點為4.66。酶學性質(zhì)研究結(jié)果表明,菌核青霉AHAUCHA 001所產(chǎn)單寧酶的最適反應溫度為40℃,熱穩(wěn)定性良好。單寧酶催化反應的最佳pH為5.0,在pH5.0-7.0之間的穩(wěn)定性較好。以沒食子酸丙酯為底物時,Km為0.929 mmol/L,Vmax為102.041μmol/L·min。有機溶劑對單寧酶催化活性具有一定的影響,除丙酮的影響不顯著以外,其他有機溶劑在一定程度上降低了單寧酶的活性,其中甘油的抑制作用最為明顯,抑制率達19.87%。與文獻報道相比,本研究表明,在最佳的條件下,菌核青霉AHAUCHA 001是一種具有實用價值的單寧酶生產(chǎn)菌株。
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925
【圖文】：

(b)沒食子酸(Gallic acid) (c)鞣花酸(Ellagic acid)圖 1.1 1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸和鞣花酸分Fig.1.1Molecular structure of 1,2,3,4,6-O-pentagalloyl glucose、Gallic acid an物對單寧的抗性工業(yè)生產(chǎn)中，人們從自然中提取了很多天然化合物，利用它保質(zhì)期，植物中的單寧物質(zhì)亦有此功能。研究表明，不同種，其中，水解型單寧的抑菌能力比縮合單寧能力稍強一點，，其對寄生蟲的入侵也具有一定抵抗能力[10]。彭凱[11]對豆科行了研究，結(jié)果表明，該植物中的單寧物質(zhì)具有較強抗菌活合能力，顯著提高了青貯發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，同時也改善了動很多微生物對單寧具有一定的抗性，有些霉菌甚至能通過攝生長。這是由于這部分微生物能夠產(chǎn)生某些胞外化合物，與而提高其對單寧物質(zhì)的耐受能能力。還有一些微生物能產(chǎn)生物質(zhì)，使其分解成小分子化合物，從而提高自身對丹寧物質(zhì)的

中心顏色較深，邊緣顏色較淺，有滲出液。菌落質(zhì)地為束狀和絮狀(圖4.1.a)。對菌核青霉 AHAUCHA 001 進行顯微觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲各細胞之間有橫隔膜，分生孢子梗頂端生有帚狀枝，在瓶梗上著生分生孢子鏈，分生孢子為球形，呈綠色(圖 4.1.b，c)。結(jié)合本實驗室前期對該菌株進行的分子生物學鑒定，進一步證明該菌株為菌核青霉。根據(jù)這一結(jié)果，按照中國典型培養(yǎng)物保藏中心樣品要求制作斜面，送樣進行保藏。4.1.2 菌核青霉 AHAUCHA 001 產(chǎn)單寧酶能力的驗證菌核青霉 AHAUCHA 001 在含單寧酸的孟加拉紅培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3 d 后，菌落周圍的單寧酸被水解，產(chǎn)生明顯透明圈(圖 4.1.d)。說明菌核青霉 AHAUCHA 001 在生長過程中能夠產(chǎn)生胞外單寧酶將菌落周邊的單寧酸水解并加以利用。圖 4.1 菌核青霉 AHAUCHA 001 形態(tài)及產(chǎn)單寧酶鑒定Fig.4.1.Culture and microscopic characteristics of AHAUCHA 001 and the identification of the ability of producing tannase圖注:其中 b、c 是用數(shù)碼顯微鏡拍攝的圖片，放大倍數(shù)為 400。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊志;龐官榮;李建平;;鉛-沒食子酸配合物分子印跡傳感器的研制及應用[J];分析科學學報;2015年04期

2 胡文斌;鄒佩;李紅歌;高琳;鄒彬;王少曼;萬茵;夏冬華;付桂明;;單寧及其微生物降解途徑研究進展[J];江西科學;2015年01期

3 楊軍國;歐鷗;陳泉賓;王麗麗;王秀萍;陳林;;單寧酶降低速溶綠茶中酯型兒茶素含量的研究[J];福建農(nóng)業(yè)學報;2015年01期

4 閔凡芹;王成章;葉建中;李文君;魯黎;;沒食子單寧降解菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J];林產(chǎn)化學與工業(yè);2014年05期

5 楊露;王姣姣;李進;劉守聰;胡逸敏;周輝;;1株產(chǎn)單寧酶細菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件研究[J];微生物學雜志;2013年06期

6 王維維;邱樹毅;謝曉莉;吳鑫穎;李廣神;何順榮;;胞外單寧酶純化及酶學性質(zhì)的研究[J];食品科學;2011年13期

7 聶光軍;刁金山;劉會;王麗;鄭之明;;應用平板顯色法測定單寧酶活力[J];應用與環(huán)境生物學報;2010年06期

8 王全杰;任方萍;高龍;;植物單寧的含量測定方法[J];西部皮革;2010年23期

9 傅長明;黃科林;王則奮;王r

本文編號：2725878