【摘要】：β-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素、頭孢、碳青霉烯類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等)是目前臨床上使用最為廣泛的一類抗生素。然而,抗生素的濫用和監(jiān)管缺失加劇了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,抗生素耐藥已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的生命健康。金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-β-lactamases,MβLs)是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要因素。近年來,攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)的超級細(xì)菌在全球的傳播引發(fā)了一場嚴(yán)重的生物醫(yī)學(xué)危機(jī),攜帶這種酶的細(xì)菌幾乎可以水解所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素。由于它編碼的質(zhì)粒基因可以水平地在不同細(xì)菌之間傳遞和其水解底物的廣譜性,使得對于它的監(jiān)測和抑制成為臨床上很大的挑戰(zhàn)。因此,對于NDM-1的監(jiān)測、標(biāo)記和抑制研究對人類健康具有極其重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價值�；谶@一思路,本文進(jìn)行了以下兩個方面的工作研究:1.基于NDM-1活性位點結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸(Cys),發(fā)展合成了18個NDM-1的共價抑制劑 1,2-苯并異噻唑-3-酮類衍生物(Ebsulfurs),通過~1H和~(13)C NMR及HRMS對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。酶動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),合成的Ebsulfurs化合物(除1a-b和1f)均對NDM-1展現(xiàn)出良好的抑制活性,IC_(50)值范圍為0.16 9μM,且是一種濃度和時間依賴性抑制劑。同時,Ebsulfurs能協(xié)同抗生素提高其抗菌活性,其中,1g、1i和1n在濃度為16μg/mL時,使得頭孢唑啉對產(chǎn)NDM-1的大腸桿菌的抗菌活性提高了256倍。平衡透析研究表明,Ebsulfurs使得NDM-1中一個Zn(II)的活性中心解體,并釋放出了一個Zn(II)。將熒光分子羅丹明B引入到Ebsulfurs,成功構(gòu)建了一個熒光抑制劑Ebs-R,通過SDS-PAGE和熒光共聚焦顯微鏡在體外和體內(nèi)對NDM-1進(jìn)行了標(biāo)記和可視化研究,進(jìn)一步證實了Ebsulfurs和靶蛋白的共價結(jié)合。對活菌體內(nèi)NDM-1的實時活性監(jiān)測表明,1g對大腸桿菌BL21細(xì)胞的IC_(50)值為35.1μM。此外,Ebsulfurs也能有效的提高頭孢唑林對產(chǎn)NDM-1臨床菌E.coli EC08的抗菌活性。Ebsulfurs對L929小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性評價結(jié)果表明,這類化合物毒性較低,可以進(jìn)一步發(fā)展為臨床潛在的MβLs抑制劑。2.以MβLs水解頭孢類抗生素的機(jī)理為理論依據(jù),建立了一種基于苯硫酚探針和苯硫酚化的頭孢底物組合的策略檢測MβLs和直接針對耐藥菌篩選其抑制劑的方法。成功構(gòu)建了一個苯硫酚化的頭孢底物Ce-s和兩個苯硫酚探針F-1和F-2。對8種巰基化合物的選擇性識別表明,探針F-2對苯硫酚類化合物展示了高度的選擇性和靈敏性。F-2監(jiān)測NDM-1水解底物Ce-s的實驗發(fā)現(xiàn),熒光探針檢測底物被酶水解是一個時間依賴和底物濃度依賴的過程。對7個文獻(xiàn)報導(dǎo)的NDM-1抑制劑在耐藥菌體內(nèi)和體外的抑制和篩選結(jié)果表明,這種方法可以用作評價和篩選MβLs抑制劑。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;TQ460.1
【圖文】：

任何生物都有面臨外界生存壓力下，為使自己免于被傷害淘汰的進(jìn)化機(jī)制。在與抗菌藥物的長期斗爭中，細(xì)菌進(jìn)化出了一套保護(hù)自己不被抗生素滅活的機(jī)制，即細(xì)菌耐藥。全球每年因細(xì)菌耐藥死亡的人數(shù)高達(dá) 70 多萬，預(yù)計到 2050 年全球每年將有 1000 萬人死于細(xì)菌耐藥，耐藥問題嚴(yán)重的危險著人類的生命和財產(chǎn)安全�？股啬退幍臋C(jī)制概括起來主要有以下四個方面[33-35]（圖 1-2）：a) 細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶：細(xì)菌通過產(chǎn)生滅活酶使抗生素失去活性，其中細(xì)菌分泌 β內(nèi)酰胺酶水解 β-內(nèi)酰胺類抗生素是其耐藥的主要原因。b) 細(xì)菌改變抗生素作用靶點：細(xì)菌通過改變抗生素與之作用的靶點位置，使藥物分子不能再與之相應(yīng)的靶點作用，進(jìn)而無法發(fā)揮抗菌活性。c) 細(xì)菌改變其外膜的通透性：細(xì)菌通過修飾自己的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜降低了自身外膜的通透性，減少了藥物分子的攝入量，從而產(chǎn)生對抗生素的耐藥。d) 細(xì)菌的藥物外排機(jī)制：長期面對抗生素的壓力，細(xì)菌主動進(jìn)化形成一種藥物外排機(jī)制，通過外排系統(tǒng)將進(jìn)入體內(nèi)的抗生素排出體外。

圖 1-6 NDM-1 的晶體結(jié)構(gòu)（A）及活性位點（B）.3 金屬 β-內(nèi)酰胺酶的檢測由于攜帶 MβLs 細(xì)菌的快速傳播和蔓延，因此 MβLs 的檢測具有十分重要的意何快速，便捷，靈敏檢測 MβLs 以及攜帶有 MβLs 的細(xì)菌已經(jīng)成為臨床研究的熱點前，在臨床上檢測 MβLs 有三種方法：表型檢測法：表型檢測法是指通過測定細(xì)菌對藥物的敏感性來判斷一種細(xì)菌是耐藥細(xì)菌，這種方法一般包括抑菌圈法、最小抑菌濃度（MIC）法、雙紙片協(xié)同。美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）根據(jù)這種方法已經(jīng)制定了一套標(biāo)準(zhǔn)的臨床檢測細(xì)菌藥敏性的方法，根據(jù)細(xì)菌對抗生素的敏感程度，判斷其是否耐藥。醫(yī)院檢測耐藥菌多用此法，這種方法也為治療耐藥菌的感染提供了很大的幫助。藥敏性實驗一般需要 24-48 h，耗時長，靈敏度和選擇性差，無法提供更多的細(xì)息，只是判斷一種細(xì)菌是否為耐藥菌的表觀方法[51,52]。

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本文編號：2721271