【摘要】：多糖廣泛分布于植物、微生物、動物及水藻中,大量研究證實天然植物多糖具有抗氧化、抗疲勞、抗過敏、抗腫瘤、抗炎、免疫調節(jié)、降血糖和益生等諸多生理活性。相較于人工合成藥物,植物多糖還具有作用效果相對較好、毒副作用小、安全性高等優(yōu)點,被認為是合成藥物的理想替代品。因此,從新植物原料中尋找活性多糖并對其結構、生物活性等進行分析已逐步成為國內外學者研究的熱點。我國竹筍資源豐富,作為世界最大的竹筍生產國和消費國,鮮筍年產量高達500~600萬噸。由于新鮮竹筍易褐變和木質化,導致其保質期不長,同時,其上市周期較短和集中。因此,大量的鮮筍需要進一步加工保藏如腌制、干制和制作罐頭等,但目前加工中存在的普遍問題是竹筍加工過程中原料浪費嚴重,如筍衣、筍渣和筍頭等加工副產物占到了竹筍原料的50%~70%,而這部分加工副產物只有少量用做動物飼料,大部分副產物都被丟棄,造成竹筍原料的浪費及環(huán)境污染。方竹(Chimonobambusa quadrangularis)因其竹稈呈四棱形略方而得名,是著名的珍貴竹種之一,其竹筍質量好,味道鮮美,深受市場歡迎。然而,方竹筍作為重慶、貴州特有的竹筍資源,在加工過程中也面臨大量加工副產物未得到有效利用和開發(fā)的問題。因此,提高方竹筍加工副產物的利用率、開發(fā)相關的高附加值產品是目前方竹筍加工中急需解決的問題。而目前國內外關于方竹筍多糖的提取、結構解析及生理活性的研究還未見有報道�；诖�,本實驗以方竹筍加工副產物的廢筍渣為研究對象,瞄準其中的多糖活性成分,對方竹筍的加工廢筍渣中多糖的提取方法進行研究,同時對比不同提取方法對方竹筍多糖理化性質和體外抗氧化及益生活性的影響,在此基礎上對方竹筍多糖進行分離和純化并對其結構進行解析,再研究方竹筍多糖純化組分的體外模擬消化和酵解特征,最后研究方竹筍多糖純化組分對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠急性潰瘍性腸炎的影響及機理,以期為方竹筍多糖臨床藥物和保健食品的開發(fā)以及方竹筍加工副產物的高附加值轉化提供理論依據和實踐指導。主要研究結果如下:(1)方竹筍的加工廢筍渣中多糖的快速溶劑提取工藝研究采用快速溶劑提取(ASE)技術提取方竹筍的加工廢筍渣中的多糖,以粗多糖得率為評價指標,通過單因素和響應面優(yōu)化實驗對其提取工藝參數進行優(yōu)化。同時與常規(guī)熱水提取法(HWE)進行對比,考察采用上述兩種方法提取得到的方竹筍多糖在得率、主要化學組成、熱穩(wěn)定性和流變學性質方面的差異。實驗結果表明,方竹筍的加工廢筍渣中多糖快速溶劑提取的最佳提取工藝條件為:筍渣粒徑Φ250 380μm,提取溫度126°C,循環(huán)次數2次,單次循環(huán)提取時間22 min。最佳提取條件下,方竹筍粗多糖的得率為9.96±0.39%,顯著高于傳統(tǒng)熱水提取法的得率(7.16±0.32%,p0.05),其提取時間遠低于傳統(tǒng)熱水提取法的單次提取時間(4 h),而兩種提取方法提取的方竹筍多糖其總糖含量和熱穩(wěn)定性無顯著差異。靜態(tài)流變學實驗結果表明,ASE提取得到的方竹筍多糖(ASE-CPS)和熱水提取法提取得到的方竹筍多糖(HWE-CPS),其溶液都表現出剪切變稀的假塑性流體特征,表觀粘度都隨著其濃度增加而增大,在相同濃度條件下,ASE-CPS的表觀粘度更大;添加CaCl_2會降低ASE-CPS和HWE-CPS溶液的表觀粘度,添加相同濃度的CaCl_2溶液,HWE-CPS溶液的表觀粘度降低的更多。動態(tài)流變學實驗結果表明,HWE-CPS和ASE-CPS為弱凝膠型多糖,添加CaCl_2可降低HWE-CPS和ASE-CPS的凝膠強度,且添加相同濃度的CaCl_2,HWE-CPS的凝膠強度降低的更多。以上結果說明,與傳統(tǒng)熱水提取法比較,ASE可作為方竹筍的加工廢筍渣中多糖的高效提取方法。(2)不同提取方法對方竹筍多糖理化性質和生物活性影響的研究分別采用快速溶劑提取、熱水提取、超聲輔助提取、微波輔助提取和復合酶輔助提取五種提取方法提取方竹筍的加工廢筍渣中的多糖,對其初步純化,最終得到5個對應的多糖樣品,并對其理化性質進行比較;再采用體外化學抗氧化法綜合比較5個多糖樣品的氧化自由基吸收能力(ORAC),清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基的能力,金屬離子螯合力和還原力;考察5個多糖樣品在人工胃液和α-淀粉酶液中的穩(wěn)定性;將上述5個多糖樣品作為碳源,加入到無碳源的MRS基礎培養(yǎng)基中,分別接種青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌4種益生菌菌種,通過體外厭氧發(fā)酵實驗,對比不同多糖樣品對益生菌的體外增殖效果及產生短鏈脂肪酸的情況。實驗結果表明,不同提取方法顯著影響方竹筍多糖的得率和某些理化性質,同時顯著影響方竹筍多糖的體外抗氧化活性和益生活性,但對方竹筍多糖在人工胃液和α-淀粉酶液中的穩(wěn)定性無顯著影響,不同提取方法制備的方竹筍多糖在人工胃液和α-淀粉酶液中均表現出較強的穩(wěn)定性(在人工胃液中水解率1.3%,在α-淀粉酶液中水解率5.0%)。理化性質方面,不同提取方法影響方竹筍多糖的得率、化學組成、單糖組成、分子量、粒徑大小、Zeta電位和三股螺旋構象�？焖偃軇┨崛》ǖ亩嗵堑寐首罡�,超聲輔助提取法制備的方竹筍多糖其糖醛酸含量最高、平均分子量最小、平均粒徑最小、Zeta電位的絕對值最大;體外抗氧化活性方面,五種提取方法制備的方竹筍多糖均表現出一定的抗氧化能力,超聲輔助提取法制備的方竹筍多糖具有更強的氧化自由基吸收能力,更強的清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基能力及更強的Fe~(2+)螯合力和還原力;體外益生活性方面,五種提取方法制備的方竹筍多糖均表現出顯著的益生活性,超聲輔助提取法和復合酶輔助提取法制備的方竹筍多糖對促進青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌體外增殖的效果更佳,能促進上述四種益生菌產生更多的短鏈脂肪酸。(3)方竹筍的加工廢筍渣中多糖的分離純化、理化性質及結構解析建立DEAE cellulose-52陰離子交換柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱兩步法分離純化方竹筍多糖工藝技術路線,對方竹筍廢筍渣中多糖進行分離純化,進一步對方竹筍多糖純化組分進行純度鑒定及分子量測定,最后采用化學分析結合儀器分析法對方竹筍多糖純化組分的結構進行解析。研究結果表明,對方竹筍粗多糖進行分離純化,最終得到PCPS-1和PCPS-2兩個純化組分,其總糖含量分別為93.26%和92.25%,糖醛酸含量分別為0.28%和0.65%,平均分子量分別為24.58 kDa和123.45 kDa;PCPS-1和PCPS-2均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成,PCPS-1對應的上述單糖摩爾百分含量分別為0.54%、0.49%、0.33%、5.93%、46.79%和45.93%,PCPS-2對應的上述單糖摩爾百分含量分別為0.46%、1.57%、1.40%、3.36%、45.82%、和47.38%;高碘酸氧化和Smith降解、甲基化分析、氣質聯(lián)機和核磁共振分析結果表明,PCPS-1和PCPS-2均主要由→5)-α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→3,6)-β-D-Galp-(1→、T-β-D-Galp、→3)-β-D-Galp-(1→和T-α-D-Glcp七種糖苷鍵組成,其中PCPS-1對應的上述糖苷鍵摩爾百分含量分別為37.16%、9.01%、17.38%、14.22%、11.19%、6.08%和4.95%;PCPS-2對應的上述糖苷鍵摩爾百分含量分別為32.87%、16.81%、16.86%、13.73%、5.91%、10.67%和3.14%;掃描電鏡結果表明,PCPS-1主要呈片狀結構,表面比較平整,而PCPS-2主要呈棒狀結構,表面比較光滑;原子力顯微鏡和圓二色譜結果顯示,PCPS-1和PCPS-2分子在水溶液中均以不規(guī)則的聚合體存在;X衍射結果表明,PCPS-1和PCPS-2中只含有少量的微晶結構,主要以無定型形態(tài)存在。(4)方竹筍多糖PCPS-2的體外模擬消化及酵解特征的研究采用人體唾液、體外模擬胃液及小腸液消化模型,研究方竹筍多糖純化組分PCPS-2的體外消化特征,并使用DEAE cellulose-52陰離子交換柱對PCPS-2的消化產物進行純化,再采用核磁共振技術對其主要糖苷鍵進行分析,用于比較PCPS-2消化前后主要糖苷鍵是否發(fā)生變化;同時,以人體糞便微菌群為酵解模型,研究方竹筍多糖的體外酵解特征。研究結果表明,PCPS-2在人體唾液、模擬胃液和小腸液中穩(wěn)定性較好,PCPS-2經人體唾液、模擬胃液和小腸液消化后,其分子量和還原糖含量未發(fā)生顯著變化,也未釋放游離單糖;方竹筍多糖PCPS-2經體外模擬消化后的核磁共振圖譜結果表明,PCPS-2經唾液、模擬胃液和小腸液消化后其主要糖苷鍵并未發(fā)生顯著變化;體外酵解實驗顯示,發(fā)酵24 h后,PCPS-2中53.36%的總糖被腸道微生物分解利用,發(fā)酵液的pH值由8.18降低到5.31,發(fā)酵液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-D-半乳糖苷酶的活性顯著增加(p0.05),發(fā)酵液中乳酸、乙酸、丙酸和總SCFAs的濃度分別從0.64、1.73、0.38和3.11 mmol/L顯著增加到8.95、14.03、7.16和31.37 mmol/L。以上結果說明,PCPS-2可被腸道微生物分解利用,能夠顯著促進腸道微生物產生SCFAs,乳酸、乙酸和丙酸為其主要的SCFAs產物。(5)方竹筍多糖PCPS-2對小鼠急性潰瘍性結腸炎的影響及其機理研究采用3%DSS誘導BALB/c雄性小鼠急性潰瘍性結腸炎模型,考察方竹筍多糖PCPS-2膳食干預下對小鼠潰瘍性結腸炎的作用效果,同時采用酶聯(lián)免疫技術、qRT-PCR技術和Western blot等技術考察PCPS-2對潰瘍性結腸炎小鼠結腸中炎癥細胞因子、iNOS和COX-2炎癥蛋白、NLRP3炎癥小體和NF-κB信號通路的影響,探討PCPS-2的可能作用機制。研究結果表明,PCPS-2對DSS誘導的小鼠急性潰瘍性結腸炎具有顯著的保護作用,具體表現為:PCPS-2可顯著改善由DSS誘發(fā)的小鼠體重減輕、糞便隱血、結腸縮短、結腸水腫與潰瘍、脾臟腫大等癥狀;可有效降低DSS對結腸組織的損傷,結腸炎小鼠結腸粘膜的潰瘍得到改善,炎性細胞的浸潤減少,隱窩結構得到一定程度恢復。PCPS-2對DSS誘導的小鼠急性潰瘍性結腸炎的保護作用主要通過以下幾種方式實現:降低結腸炎小鼠結腸中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表達量,改善結腸炎小鼠結腸中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和IL-18與抗炎細胞因子IL-10間的平衡狀態(tài);通過降低結腸炎小鼠血清中NO分泌量、減少結腸組織中MDA含量、提高T-SOD活力、降低MPO活力從而抑制結腸炎小鼠機體的氧化應激反應,修復組織損傷;下調結腸炎小鼠結腸中炎癥蛋白iNOS和COX-2的表達;抑制結腸炎小鼠結腸中NLRP3炎癥小體的激活;抑制結腸炎小鼠結腸的NF-κB信號通路中p65和IκB-α蛋白的磷酸化。結論:本實驗成功建立了方竹筍的加工廢筍渣中多糖的快速溶劑提取新工藝,同時建立了DEAE cellulose-52陰離子交換柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱兩步法分離純化方竹筍多糖工藝技術路線;證實了提取方法顯著影響方竹筍多糖的體外抗氧化活性和益生活性,其中超聲輔助提取法制備的方竹筍多糖表現出更顯著的體外抗氧化活性和益生活性;方竹筍多糖純化組分PCPS-1和PCPS-2的主要結構特點為兩個純化組分均主要含→3,5)-α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→3,6)-β-D-Galp-(1→、T-β-D-Galp、→3)-β-D-Galp-(1→和T-α-D-Glcp七種糖苷鍵;證實了PCPS-2可抵抗人體唾液、模擬胃液和小腸液的消化作用,且經體外模擬消化后其主要糖苷鍵并未發(fā)生顯著變化;進一步證明了PCPS-2能夠被腸道微生物分解利用,能夠顯著促進腸道微生物產生乳酸、乙酸和丙酸;最后發(fā)現PCPS-2對DSS誘導的小鼠急性潰瘍性結腸炎具有顯著的保護作用,證明其主要通過降低潰瘍性結腸炎小鼠結腸中促炎細胞因子、炎癥蛋白iNOS和COX-2的表達,改善結腸炎小鼠機體的氧化應激,抑制結腸炎小鼠結腸中NLRP3炎癥小體的激活,抑制結腸炎小鼠結腸的NF-κB信號通路中p65和IκB-α蛋白的磷酸化這幾種方式實現對小鼠急性潰瘍性結腸炎的保護作用。
【圖文】：

圖 1-1 從竹筍加工副產物和廢水中開發(fā)附加值產品的生物精煉建議流程圖[30]Fig. 1-1 Proposed flow chart for abiorefinery approach to the development of value-added producfrom waste bamboo shoot processing residue and processing waste water.2 植物多糖的研究進展.2.1 多糖簡介多糖（Polysaccharides）是由酮糖、醛糖或其衍生物通過不同類型的糖苷鍵而成的天然高分子聚合物。多糖廣泛分布于高等植物和微生物的細胞壁及動胞膜中，除為機體的結構物質和為機體提供能量物質外，還廣泛參與機體的合成反應及細胞的各項生命活動，如細胞的識別、細胞間信號通路的傳導等[3有生物活性的多糖一般指由十個以上單糖分子通過糖苷鍵連接起來的線性或支鏈的高分子聚合物，，其分子量分布范圍較廣泛，可從數萬到幾百萬[36]。多據原料來源的不同，可分為植物多糖、微生物多糖和動物多糖；根據其分子分支情況，可以分為直鏈多糖和支鏈多糖。與蛋白質類似，多糖的結構可分級、二級、三級和四級結構，但多糖的一級結構包含的信息較蛋白質一級結

圖 1-2 植物多糖不同提取方法的機理[53]-2 The mechanism of different extraction methods for plant polysac取法的溶劑提取法根據提取溶劑的不同，又分為熱水提取法。水提取法：該方法為植物多糖提取廣泛采用的方法，將多糖提取液，利用多糖不溶于有機試劑溶于水的性質，離心后收集沉淀得到粗多糖。提取時間、溫度、料搖為多糖提取效率的影響因素。該方法的優(yōu)點是操作要提取 2～6 h，某些大分子多糖不溶于熱水[55]（表 1-堿提取法：某些不溶于熱水的酸性多糖或大分子多糖可選用 5～15%（w/w）的 NaOH 或 Na2CO3溶液為提取降解，提取溫度不能超過 10 °C。該方法的優(yōu)點是多糖需嚴格控制溫度，多糖可能發(fā)生部分降解[56]（表 1-2）酸提取法：由于植物多糖在酸性條件下易發(fā)生降解，其
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ281;TS209

【參考文獻】

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本文編號：2693339