【摘要】：L-瓜氨酸(L-citrulline)是一種α氨基酸,具有抗疲勞、抗衰老、提高免疫力和提升男性性功能等活性,在醫(yī)藥、保健品行業(yè)應(yīng)用廣泛。L-瓜氨酸可以由精氨酸脫亞胺酶(Arginine Deiminase,簡稱ADI)轉(zhuǎn)化L-精氨酸得到。紅曲霉(Monascus)是一種重要的工業(yè)微生物發(fā)酵菌,在食品、藥品和保健品領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力,其發(fā)酵產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)血脂、血壓的功能,對糖尿病、帕金森病等多種疾病有較好的預(yù)防和治療效果。本課題采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),將外源ADI基因隨機(jī)插入紅曲霉基因組中,構(gòu)建了一種胞內(nèi)組成型表達(dá)ADI的紅曲霉工程菌。此工程菌可以用于L-瓜氨酸的生產(chǎn)及紅曲相關(guān)保健品的開發(fā)。本課題采用無縫克隆技術(shù)將支原體來源的ADI基因與線性化微型Ti載體p CAMBIA-Pgpd A-Tcbh1-hph-Ptrp C進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至克隆宿主大腸埃希氏菌E.coli DH5α;提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,經(jīng)基因測序篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。至此,用于胞內(nèi)組成型表達(dá)ADI的微型Ti載體p CAMBIA-Pgpd A-ADI-Tcbh1-hph-Ptrp C已構(gòu)建完成。采用多種條件制備根瘤農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞,將微型Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌,結(jié)果表明采用50 mmol/L Ca Cl2制備的根瘤農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化子數(shù)量最高。采用該條件將微型Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根瘤農(nóng)桿菌中,PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。將紅曲霉孢子懸浮液與根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子于24℃共培養(yǎng),培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中。將篩選培養(yǎng)基中的紅曲霉抗性菌落用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)液用薄層色譜法和二乙酰一肟法檢測L-瓜氨酸生產(chǎn)情況。提取能產(chǎn)生L-瓜氨酸的紅曲霉轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定,并研究其遺傳穩(wěn)定性。最終得到兩個轉(zhuǎn)化子:6號菌與7號菌,性狀與野生型紅曲霉相近,PCR鑒定ADI基因已成功插入至紅曲霉基因組中,證明胞內(nèi)組成型表達(dá)ADI的紅曲霉工程菌構(gòu)建成功。
【圖文】：

11圖 2-1 質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)路線圖Fig. 2-1 Strategy for construction of plasmids2.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)過程中使用的主要設(shè)備和儀器列于表 2-1

浙江工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文少有 16 bp 引物與模板互補(bǔ)配對。1-F 5’-AGCTCCGTGGCGAAAGCCTGAC-R 5’-CATTGTGATGTCTGCTCAAGCGG的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖 2-2 和圖 2-3：
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ922

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9 孫s，

本文編號：2687534