發(fā)布時間：2020-05-26 10:44

【摘要】：近年來,生物制藥行業(yè)的迅猛發(fā)展�？贵w藥物作為生物制藥行業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)越來越受到重視,通過發(fā)酵過程生產(chǎn)的抗體藥物其質(zhì)量和產(chǎn)量會受到發(fā)酵過程中一些關(guān)鍵參數(shù)的影響,因此在生產(chǎn)過程中需要對其進行監(jiān)測。在巴斯德畢赤酵母發(fā)酵過程中,第一階段中生物量的增長和甘油的消耗對于選擇誘導(dǎo)時間至關(guān)重要,準確的選擇對數(shù)生長期,在生產(chǎn)中可以節(jié)約更多的能源和時間,有利于得到足夠數(shù)量的代謝旺盛的酵母細胞。在第二階段,甲醇作為啟動子,合適的濃度舉足輕重,甲醇濃度過低會導(dǎo)致細胞溶解、分泌的蛋白難以聚合。反之,甲醇濃度過高則會抑制細胞增長和蛋白表達,因此在生產(chǎn)過程中需要對以上3個參數(shù)進行測定和控制。而在參數(shù)測定的過程中有兩個困難需要克服,一是由于發(fā)酵液的復(fù)雜性和菌體的擾動,所以光譜的質(zhì)量需要提高。為此,本研究引入了差譜方法的概念,先前研究已經(jīng)證明差譜法的優(yōu)越性,本文對比了減去同一張溶劑法、依次相減法和最小面積法,以便能最大程度提高光譜的質(zhì)量。二是甘油、甲醇含量比較低,近紅外光譜技術(shù)屬于二級方法,故本研究引入了水光譜組學(xué)的概念。水光譜組學(xué)可利用擾動要素對水的光譜的影響,實現(xiàn)對其它物質(zhì)的監(jiān)控,這已成功應(yīng)用于監(jiān)測低濃度的蛋白質(zhì)、糖等,該技術(shù)為準確監(jiān)測甘油、甲醇含量提供了一種新的可能性。因此,本研究首先利用簡單體系考察了差譜法和水光譜組學(xué)的可行性,而后將其結(jié)合近紅外光譜技術(shù)引入到巴斯德畢赤酵母發(fā)酵過程中生物量、甘油、甲醇的測定過程中,進一步探究近紅外光譜技術(shù)結(jié)合差譜法、水光譜組學(xué)在其發(fā)酵過程中的可行性。本文具體內(nèi)容如下:(1)三種不同差譜方法的研究。本章研究中利用Antaris II傅立葉變換近紅外光譜儀對三種差譜法(減去同一張溶劑法、依次相減法、最小面積法)在甲醇-水溶液簡單體系中的優(yōu)越性進行了探究,以便能最大程度上提高光譜的質(zhì)量。首先,配制0.1-2.5%(v/v)的甲醇-水溶液,間隔0.1%,分直接稀釋和梯度稀釋,一式兩份,共100個樣品,在實驗室條件下進行。借助于偏最小二乘回歸(partial least squares regression,PLSR)模型中的回歸系數(shù)考察了直接稀釋法和梯度系數(shù)法兩種溶液配制方法,結(jié)果顯示這兩種溶液配制方法無顯著性差異,對模型的準確度影響不大。在直接稀釋基礎(chǔ)上考察了上述三種差譜方法,以交叉驗證均方根誤差(root mean square error of cross validation,RMSECV)值為主要評判標準,結(jié)果顯示依次相減差譜法建模效果最佳,面積最小法次之,最差的是減去同一張光譜法,但是仍然比傳統(tǒng)的3張光譜取平均建模法的RMSECV值低50%左右。(2)水光譜組學(xué)用于畢赤酵母發(fā)酵過程的可行性研究。本研究考察了近紅外光譜技術(shù)結(jié)合水光譜組學(xué)對甲醇-培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD、、luria-bertani,LB、yeast extract peptone ethanol glycerin,YEPG)體系中甲醇含量測定的可行性。首先,實驗室條件下利用直接稀釋法配制甲醇濃度范圍在0.1-2.5%(v/v)之間的甲醇-培養(yǎng)基(YPD、LB、YEPG)溶液,間隔0.1%,每種培養(yǎng)基有25個樣品。其次,選擇12個水基質(zhì)坐標(water matrix coordinates:WAMACS,7149 cm--1、7082 cm--1、6954 cm-11、6940 cm-11、6900 cm-1、6871 cm--1、6836 cm--1、6773 cm--1、6702 cm--1、6667 cm--1、6509 cm--1、6400 cm-1),通過雷達圖反應(yīng)甲醇的存在對水光譜的影響。結(jié)果顯示即使甲醇的加入量是0.1%,仍可以對原溶液的吸光度產(chǎn)生影響。然后,利用PLSR建立了水光譜組學(xué)用于低含量甲醇測定的回歸分析模型。以甲醇-YPD溶液為例,最佳模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv2和Rp2值分別是0.014%,0.03 8%,0.047%,1.000,0.997,0.999。甲醇-LB培養(yǎng)基和甲醇-YEPG培養(yǎng)基得到的結(jié)果和上述的結(jié)果均類似,結(jié)果證明水光譜組學(xué)可以用于甲醇含量的測定,為低含量甲醇的測定提供了一個新的思路。(3)畢赤酵母發(fā)酵過程關(guān)鍵參數(shù):生物量、甘油、甲醇的測定。本研究將上述得到的結(jié)論用于巴斯德畢赤酵母實際發(fā)酵過程中關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù):生物量、甘油、甲醇含量的測定。首先在搖瓶水平上分別平行4次試驗(第一階段)、5次試驗(第一階段),從巴斯德畢赤酵母發(fā)酵過程的第一階段和第二階段分別取100個和110個樣品,其中第一階段的樣品包含了生物量和甘油含量的變化,第二階段的樣品包含了甲醇含量的變化。這三者的一級數(shù)據(jù)分別通過紫外分光光度計、甘油含量測定試劑盒、氣相色譜法測得。在建模之前,分別對異常點的剔除、數(shù)據(jù)集劃分和光譜預(yù)處理方法進行了優(yōu)化。最終,生物量最佳的LWR模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv2、Rp2值分別是0.0615、0.105、0.101、0.994、0.982、0.980;甘油的LWR模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv2、Rp2值分別是0.243、1.037、0.765、0.997、0.951、0.963;甲醇的PLSR模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv.2、Rp2值分別是0.128、0.141、0.149、0.924、0.907、0.852;這三個模型可以實現(xiàn)快速、準確地對巴斯德畢赤酵母發(fā)酵過程中生物量、甘油和甲醇的定量檢測。本論文的創(chuàng)新點包括:(1)本研究首次選擇了12個WAMACS,用于反應(yīng)甲醇對水光譜的影響,考察了水光譜組學(xué)用于發(fā)酵過程中的可行性。(2)本研究首次建立了差譜法和水光譜組學(xué)用于測定發(fā)酵過程中關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)(生物量、甘油、甲醇)的NIR方法。
【圖文】：

Ｉ邋．．ｆ邐），邋Ｍ＞邋？0邋；ｆ．邋ｉ？邋．．．邐＇邋．！（邐？＜？＜？．，，，邐ｉ．．逡逑圖１－２傅里葉變化型近紅外光譜儀原理圖逡逑２．２近紅外光譜分析技術(shù)的優(yōu)缺點逡逑近紅外光譜分析技術(shù)之所以能在短短的１０多年內(nèi)，在眾多領(lǐng)域得到了廣泛逡逑的運用，進而在數(shù)據(jù)處理及儀器制造方面有如此迅速的發(fā)展，，主要因為它在分析逡逑測定中有其無可復(fù)制的優(yōu)越性［｜１］，見圖１－３所示。逡逑（１）可以用于樣品的定性．也能夠用于樣品的定置。定性一般是指逡逑先取得一組己知樣品的光諧建立模型，再洌得待定性樣品的光諳．用逡逑~k類原理確定該樣品是否屬于該組樣品的一類。如果樣品有好幾類，逡逑則可建立多個模型．用未知樣品的諸圖來確定其所屬類型。例如．在逡逑輔料鑒別中．區(qū)分不同來源的疏酸軟骨素（豬和鯊魚來源）。定量一逡逑般是指采用多元校正方法及一組己知性質(zhì)或組分的樣品所建立的模型。逡逑例如．建立５油

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