發(fā)布時間：2020-05-21 12:35

【摘要】：低聚半乳糖(GOS)是一類益生效果良好的低聚糖,被廣泛應用于食品和保健品行業(yè)。工業(yè)上一般采用β-半乳糖苷酶催化乳糖獲得。目前,日本擁有比較成熟的工業(yè)生產(chǎn)技術,年產(chǎn)量也居于世界首位,而國內(nèi)由于欠缺性能較好的β-半乳糖苷酶、生產(chǎn)技術落后等原因,目前對GOS的生產(chǎn)還處于落后水平。本研究將米曲霉(Aspergillus oryzae RIB40)來源的β-半乳糖苷酶連接到表達載體pPIC9K上,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris KM71),獲得了能夠表達β-半乳糖苷酶的重組菌。通過定點突變的方法獲得了三株轉(zhuǎn)苷能力提升的突變體,并對突變體及野生型酶生產(chǎn)GOS的反應條件進行了優(yōu)化,對轉(zhuǎn)苷能力最高的雙突變體N140C/W806進行了3 L罐發(fā)酵,最后分析了突變體產(chǎn)生效果的原因,并對原因進行了驗證。主要研究結(jié)果如下:(1)將米曲霉來源的β-半乳糖苷酶基因連接表達載體,轉(zhuǎn)入Pichia pastoris KM71,獲得能夠高效表達β-半乳糖苷酶的重組菌,搖瓶酶活達到198.7 U·mL~(-1),對野生型基因進行定點突變,獲得了多株轉(zhuǎn)苷能力提升的突變株。對突變體動力學參數(shù)進行分析,其中,N140C及N140C/W806F突變體對乳糖的K_m值比野生型酶有所提高,說明兩個突變體對乳糖親和力下降,水解活性降低,符合實驗預期。(2)對突變體及野生型酶生產(chǎn)GOS的條件進行了優(yōu)化。兩個單突變體生產(chǎn)GOS的能力均比野生型有所提高,其中W806F突變體在最優(yōu)條件下生產(chǎn)GOS的產(chǎn)率達到49.3%,N140C單突變體最優(yōu)條件下生產(chǎn)GOS的產(chǎn)率達到50.7%,比野生型酶分別提高了35.2%及31.5%。雙突變體N140C/W806F的最佳反應條件:乳糖濃度600 g·L~(-1)、加酶量2.5U·mL~(-1)、反應溫度為40℃,反應pH 4.5,反應時間7 h。其最終產(chǎn)率為59.8%,比野生型提高了59.2%。對雙突變體N140C/W806F進行了3 L罐發(fā)酵優(yōu)化,確定最佳誘導溫度為28℃,此時雙突變體酶活達到65.3 U·mL~(-1),比搖瓶提高4.44倍。(3)對突變體產(chǎn)生效果的原因進行了分析,認為N140C突變點氨基酸殘基的改變導致半乳糖基氫鍵的破壞,從而影響水解反應和轉(zhuǎn)苷反應,使得轉(zhuǎn)苷反應相對占據(jù)優(yōu)勢,進而最終提高產(chǎn)率。W806F突變產(chǎn)生的效果與此位置疏水性增加有關,疏水性增強降低了水作為受體參與反應的機會,相應的糖基作為受體的反應得到增強,從而提高轉(zhuǎn)苷能力。設計正向突變N140A以及反向突變W806H,其中N140A突變后,生產(chǎn)GOS的產(chǎn)率達到44.9%,比野生型高19.7%,W806H生產(chǎn)GOS產(chǎn)率為22.7%,比野生型降低,成功驗證了我們對突變產(chǎn)生效果原因的推測。
【圖文】：

第一章 緒論1.1 β-半乳糖苷酶概述1.1.1 β-半乳糖苷酶的來源β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase, EC 3.2.1.23)，也稱乳糖酶，具有水解乳糖的作用，能夠?qū)⑷樘撬獬砂肴樘呛推咸烟荹1]，通常在乳制品行業(yè)中用來降低乳制品中乳糖含量，解決乳糖不耐癥；除了水解乳糖外，β-半乳糖苷酶還具有轉(zhuǎn)苷能力，，可以利用乳糖合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶在自然界中廣泛存在，不僅存在于細菌、真菌、霉菌等常見微生物中，而且在動物的皮膚和腸道組織[2-4]、植物的葉莖種子[5-7]也廣泛存在。其中，對微生物來源的 β-半乳糖苷酶研究最為廣泛[1, 7-9]。目前市場上商品化的 β-半乳糖苷酶有很多，具體如表 1.1 所示。表 1.1 商業(yè)性的 β-半乳糖苷酶來源Table 1.1 Commercial sources of some β-galactosidase

圖 1-1 β-半乳糖苷酶催化合成 GOS 機制Fig. 1-1 β-galactosidase catalyzes the synthesis of GOS1.1.3 不同來源 β-半乳糖苷酶的性質(zhì)比較不同來源的 β-半乳糖苷酶性質(zhì)各異，正是這種性質(zhì)的多樣性大大提高了其在食品工業(yè)的應用。盡管不同來源 β-半乳糖苷酶的應用很廣，但對于生產(chǎn)低聚半乳糖來說，真菌來源的 β-半乳糖苷酶卻一直占據(jù)著主導地位。其中，作為食品安全菌的曲霉以及克魯維酵母屬來源的β-半乳糖苷酶的研究最為廣泛。例如，Dragosits等研究了Aspergillus nidulan以及 Aspergillus niger 的生物應用及糖學應用[12]，F(xiàn)rezel 等比較了米曲霉、棘孢曲霉以及克魯維乳酸菌來源的 β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)苷能力[13]。除了具有食品安全菌的優(yōu)良特性外，反應pH偏酸性也是真菌來源β-半乳糖苷酶的優(yōu)勢。例如，Kluyveromyces fragilis和A. nige來源的 β-半乳糖苷酶最適 pH 為 4.0 4.5 ，并且在 pH 3.0 7.0 之間穩(wěn)定性都比較好，最適溫度為 55℃，比較適用于酸性乳酪中乳糖的水解[14]。Isobe 等從溫泉中分離出Teratosphaeria acidotherma AIU BGA-1，發(fā)現(xiàn)其來源的 β-半乳糖苷酶能夠在酸性到中性pH 范圍內(nèi)均保持很高的活性[15]。另外，對真菌來源的 β-半乳糖苷酶的定向進化以及晶體
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925;TQ281

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本文編號：2674307