【摘要】：連翹花為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)vahl的干燥花。連翹作為山西的道地藥材,傳統(tǒng)以果實(shí)入藥,其花通常被棄用,造成很大程度上的資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作顯示,連翹花具有美白功效。因此,為了充分利用連翹花資源和探究連翹花美白物質(zhì)基礎(chǔ),本文首先對(duì)連翹花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究,為有效控制化妝品原料的質(zhì)量一致性提供依據(jù);在此基礎(chǔ)上以酪氨酸酶為作用靶點(diǎn),分別在分子水平和細(xì)胞水平對(duì)連翹花提取物進(jìn)行了抑酶作用的研究,探討并尋找抑酶有效部位和活性成分。進(jìn)一步研究了連翹花提取物抑酶有效部位的制備工藝,并測(cè)定了有效部位化學(xué)成分的含量,以期為連翹花作為天然的美白劑應(yīng)用于化妝品行業(yè)提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:1.對(duì)7批連翹花進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)研究,包括檢查項(xiàng)(水分和總灰分)、浸出物量、指標(biāo)性成分含量測(cè)定及特征圖譜的建立等。根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》的測(cè)定方法,水分的檢查按照附錄IXH項(xiàng)下烘干法,擬定水分含量不得超過10%;總灰分的檢查按照附錄IXK項(xiàng)方法,擬定總灰分含量不得超過7%;浸出物按照附錄X項(xiàng)方法,擬定浸出物含量不得少于28%。建立HPLC方法測(cè)定連翹花中連翹酯苷A、蘆丁、連翹苷含量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬定了連翹花指標(biāo)性成分的含量最低限量,即連翹酯苷A的含量不得低于3.0%,蘆丁的含量不得低于2.7%,連翹苷的含量不得低于0.8%。利用HPLC法建立連翹花的特征圖譜,根據(jù)對(duì)7批樣品的測(cè)定分析,擬定特征圖譜中的共有峰(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷作為連翹花特征峰。2.采用大孔樹脂D101柱對(duì)連翹花水提物進(jìn)行粗分離,得到H-1、H-2、H-3、H-4、H-5五個(gè)組分;首先在分子水平對(duì)連翹花粗提物及五個(gè)洗脫部位進(jìn)行抑制蘑菇酪氨酸酶活性的篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:連翹花的粗提物體現(xiàn)出對(duì)酪氨酸酶活性具有抑制作用,且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增大,抑制率呈上升趨勢(shì)。其中,H-3部位表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,其IC_(50)為0.82 mg/mL與陽性對(duì)照物熊果苷相近。進(jìn)一步在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證,H-3部位對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性亦有較強(qiáng)的抑制作用,同時(shí)其產(chǎn)生的黑色素含量最低。因此,有效部位H-3可能是一種潛在的黑色素合成抑制劑。3.利用凝膠柱層析與制備型高效液相色譜對(duì)H-3有效部位進(jìn)行成分分離鑒定,分離得到5個(gè)化合物。其中通過HPLC分析及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定了3個(gè)化合物,分別為(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁。此外,利用核磁共振~(13)C NMR及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定另2個(gè)化合物分別為異連翹酯苷和連翹酯苷H。進(jìn)一步在分子水平和細(xì)胞水平上,對(duì)分離得到5個(gè)成分進(jìn)行了抑制酪氨酸酶酶活力測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異連翹酯苷和連翹酯苷A對(duì)酪氨酸酶酶活抑制能力最強(qiáng),同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的黑色素合成具有較強(qiáng)抑制率。據(jù)此推測(cè)異連翹酯苷和連翹酯苷A是抑酶作用的主要成分。4.通過大孔樹脂對(duì)H-3有效部位進(jìn)行中壓制備工藝研究。方法:以有效部位內(nèi)5種指標(biāo)成分(異連翹酯苷、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷H、連翹酯苷A、蘆丁)的HPLC圖譜分析為依據(jù),考察了樣品上樣量和洗脫體積。并對(duì)洗脫物進(jìn)行得率及抑酶實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。最終確定大孔樹脂中壓制備工藝的最佳條件為:柱材料為95 g,上樣濃度為200 mg/mL,洗脫流速為20 mL/min時(shí),上樣量為14 g,棄去1.6 L水洗脫液和1.6 L 20%乙醇洗脫液,收集2.4 L 40%乙醇洗脫液并減壓濃縮干燥,得到H-3部位。為后續(xù)有效部位的中試工藝規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)有效的方法。5.采用HPLC色譜法對(duì)5批H-3有效部位樣品中已確認(rèn)的5種成分的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,5批樣品中5種成分的總含量均達(dá)到H-3有效部位含量的50%,且RSD=3.97%,說明該制備方法得到的樣品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定可靠。
【圖文】：

第二章 連翹花標(biāo)準(zhǔn)初步研究1-4 號(hào)色譜峰為共有峰，，且峰面積相對(duì)較大。所以，將這 4 個(gè)峰作為連翹花特征圖譜中的特征峰。根據(jù)上述 7 批樣品的測(cè)定結(jié)果，選擇各批樣品均具有的主要色譜峰作為對(duì)照特征圖譜（如圖 2.2A），將實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同的色譜條件下進(jìn)樣分析（如圖 2.2B），并與連翹花特征圖譜中的色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，最終確定圖譜峰中的峰 1 為(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、峰 2 為連翹酯苷 A、峰 3 為蘆丁、峰 4 為連翹苷。2

圖 2.2 連翹花對(duì)照特征圖譜及其特征峰指認(rèn)Fig 2.2 F.suspensa flower comparison feature map and its characteristic peak identification峰 1 為(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-pinoresinol-β-D-glucopyranoside)；峰 2為連翹酯苷 A(forsythiaside A)；峰 3 為蘆丁(rutin)；峰 4 為連翹苷(philliyrin)圖 A 為連翹花樣品圖譜 圖 B 為標(biāo)準(zhǔn)品圖譜 小結(jié)1．對(duì) 7 批連翹花進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)研究，包括檢查項(xiàng)（水分和總灰分）、浸出物量、指成分含量測(cè)定及特征圖譜的建立等。根據(jù) 2015 版《中國(guó)藥典》的測(cè)定方法，水檢查按照附錄 IXH 項(xiàng)下烘干法，擬定水分含量不得超過 10%；總灰分的檢查按錄 IXK 項(xiàng)方法，擬定總灰分含量不得超過 7%；浸出物按照附錄 X 項(xiàng)方法，擬出物含量不得少于 28%。不同產(chǎn)地的藥材檢查項(xiàng)及浸出物含量之間的差異可能材的地域有關(guān)，還可能與預(yù)處理方式和采收期（花蕾期、盛花期、結(jié)果期）等。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ658

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