【摘要】：幾丁質是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚合物,是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源。N-乙酰-D-氨基葡萄糖是幾丁質的完全降解產物,其在醫(yī)藥、食品、肥料、日化和能源等方面具有廣泛的應用價值。目前,幾丁質降解的傳統(tǒng)方式是化學酸堿法進行降解,而在其降解過程中存在降解產物不純和產生大量酸堿廢液等缺點,使得幾丁質資源未得到合理利用。而酶法降解幾丁質是一種無污染、低成本、操作簡單、產物易控制的高效降解方法。因此,生物酶法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學法來生產N-乙酰-D-氨基葡萄糖,是具有巨大的社會、經濟價值以及學術價值的綠色可代替方法,是社會發(fā)展的必然。由于天然幾丁質的不溶性嚴重阻礙了酶法降解幾丁質的效率,因此,本研究模仿了纖維小體的結構,設計了人工幾丁質小體,它能通過蛋白支架Scaf將幾丁質內切酶(SaChiB)、幾丁質外切酶(SaHex)以及裂解多糖單加氧酶(LPMO)連接起來,協同降解幾丁質小體以實現目的酶和底物的空間定位,進而通過不同種類的酶來實現高效降解幾丁質的目的。1、本研究根據纖維小體的模式設計了人工“幾丁質小體”。通過Linker將幾丁質結合結構域(CBD)與3種不同的Cohesin連接構成幾丁質小體中重要的蛋白支架Scaf,Scaf不具有降解幾丁質的活性。2、PCR擴增三種具有協同作用的幾丁質酶基因以及不同來源的Dockerin基因,通過無縫克隆的方法成功得到了重組質粒pET30a(+)-LPMO-Dockerin、pET30a(+)-Dockerin-SaHex、pET30a(+)-SaChiB-Dockerin。3、將帶有重組酶基因的三種質粒以及合成的支架蛋白Scaf轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,并得到了高效表達,重組蛋白及支架蛋白通過Ni-NTA純化后,等摩爾比進行自組裝,經Native-PAGE凝膠檢測試驗表明,蛋白組裝成功。4、對組裝后的幾丁質小體進行酶學性質試驗,結果表明其最適pH為8.0,最適溫度為30℃。通過最適酶量試驗表明,其最適加酶量為40μM。通過幾丁質小體與游離酶降解幾丁質效果比較試驗表明,在最佳反應條件下,與游離酶組合體系相比,幾丁質小體的降解效率提高了2.53倍。
【圖文】：

由微生物進行分泌的幾丁質酶種類多樣，種類不同的幾丁質酶，它們的結構與性質有很大的差異，根據酶與底物發(fā)生反應的不同位置、降解后產生的產物可以將幾丁質酶劃分為以下三類：（1）幾丁質內切酶（endochitinase EC3.2.1.14）沿著幾丁質鏈隨機進行切割糖苷鍵，生成二聚體（二乙�；鶜ざ牵┖陀� GlcNAc 組成的可溶性低分子量多聚體，例如殼三糖和殼寡糖[16]。（2）幾丁質外切酶（exochitinase）將幾丁質內切酶與幾丁質反應后的產物進一步進行水解反應[16]�？煞譃閮蓚�亞類：一類是幾丁二糖酶（chitobiosidase，EC3.2.1.29），可從多糖的非還原端裂解幾丁質或者幾丁質寡聚物，，釋放的最終產物主要是二乙酰幾丁 二 糖 [(GlcNAc)2] ； 另 一 類 為 N- 乙 酰 -D- 氨 基 葡 萄 糖 苷 酶（N-acetylglucosaminidases，EC3.2.1.30），和幾丁二糖酶類似，都可從糖鏈的非還原端開始裂解幾丁質或幾丁質寡聚物，生成單體 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，它也是唯一能水解(GlcNAc)2的酶[17-19]。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶大部分屬于 20 家族[20]。但是還有部分糖苷水解酶屬于 3 家族包括 Alteromonas sp. Cht60，E. coli Nag Z[22]，S.thermoviolaceus Nag A[23]，V. furnissii Exo II[24]等，均來源于微生物。

圖 3.熱纖梭菌纖維小體模型Fig.3. The architecture of the cellulosome from C. thermocellum圖 4. 熱纖梭菌 CipA 基因簇Fig.4. Cip A gene cluster from C. thermocellum人工纖維小體的構建著纖維素小體研究的不斷深入，纖維小體在轉化纖維素晶體成可利用單了較為深入的成果。作為一種高效的纖維素降解機器，纖維素小體的人始取得成果，已經成為研究及改造自然界中纖維素小體的有力工具。研簡單、具有必備元件（支架蛋白和重組酶模塊）的微型纖維素小體(cellas; )[45]，這種纖維小體遵照了自然界中纖維小體的一般構成規(guī)則，不同
【學位授予單位】：河北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ317

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 關海寧;徐桂花;刁小琴;;微生物產幾丁質酶的研究概況及其應用[J];中國食物與營養(yǎng);2006年08期

2 周櫻,王風平,肖湘;豚鼠氣單胞菌CB101中幾丁質酶基因的克隆及其異源表達的全酶蛋白和酶片段的功能研究[J];自然科學進展;2002年08期

相關碩士學位論文 前1條

1 劉海泉;嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定幾丁質酶基因的克隆、表達與性質研究[D];山東農業(yè)大學;2008年

本文編號：2658678