【摘要】：化石燃料的儲(chǔ)備量急劇下降,溫室效應(yīng)日益加劇,清潔能源纖維素乙醇成為各國的研究熱點(diǎn)。纖維素乙醇以木質(zhì)纖維素為原料,木質(zhì)纖維素預(yù)處理產(chǎn)生的抑制物尤其是糠醛會(huì)嚴(yán)重抑制菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)醇。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌因其具有眾多良好的特性成為生產(chǎn)乙醇的優(yōu)勢(shì)菌株,但是其生長(zhǎng)和產(chǎn)醇也會(huì)受到糠醛的嚴(yán)重抑制,因此,獲得具有糠醛耐受性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對(duì)工業(yè)乙醇的生產(chǎn)有著重要的意義。本次研究以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4為出發(fā)菌種,首次嘗試易錯(cuò)PCR全基因組改組技術(shù)改造該菌種,獲得了糠醛耐受突變體F211和F27。3 g/L糠醛脅迫下,突變體F211和F27的最大細(xì)胞密度比CP4高140-149%,且達(dá)到最大細(xì)胞密度所需的時(shí)間比CP4快約16 h,突變體的乙醇得率比CP4高115-118%,并且突變體具有穩(wěn)定遺傳的糠醛耐受性。在2 g/L和3 g/L糠醛條件下,突變體F211和F27生長(zhǎng)和發(fā)酵均快于出發(fā)菌株CP4,1 g/L糠醛為抑制菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵的最小濃度。葡萄糖濃度為15-20%(w/v)的培養(yǎng)基中,突變體F211和F27的生長(zhǎng)和產(chǎn)醇速率顯著快于出發(fā)菌株,說明糠醛耐受突變體同時(shí)具有高濃度葡萄糖糖耐受性。突變體的糠醛還原酶活性顯著高于出發(fā)菌株CP4,說明突變體通過加速糠醛還原而提高其糠醛耐受性。重測(cè)序表明突變體F211和F27分別有12和13個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。突變基因功能的初步研究表明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因缺失菌株CP4-△1431糠醛耐受性和糠醛還原酶活性均提高;外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因缺失菌株CP4-△0525糠醛耐受性降低。上述結(jié)果表明突變體F211和F27可能通過調(diào)節(jié)糠醛還原酶基因的表達(dá),加速糠醛的還原和外排來提高菌株的耐受性。綜上所述,首次使用易錯(cuò)PCR全基因組改組技術(shù)改造運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌,并獲得了耐受糠醛、且遺傳穩(wěn)定的突變菌株,為運(yùn)用該技術(shù)快速高效改善運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對(duì)纖維素水解液抑制物的耐受性提供了基礎(chǔ)。突變體糠醛耐受性的關(guān)鍵突變位點(diǎn)的功能鑒定為闡明該菌糠醛耐受的機(jī)制、運(yùn)用反向代謝工程構(gòu)建耐受菌株奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

-1 以 Z.mobilis CP4 基因組為模板得到的易錯(cuò) PCR 產(chǎn)物電泳圖 the electrophorogram of ePCR products amplified from Z.mobililis CP4 的基因組。圖 b 和 c 為易錯(cuò) PCR 產(chǎn)物。P4 的基因組，大小 2 M；泳道 2：Marker D15000 (TIANGE)， bp; b: 3-6 泳道：不同引物組合的 PCR 產(chǎn)物，引物組合為 1 15 mer (6.6 μL) 和14 mer (10 μL), 12 mer (16.6 μL), 15 mer (1r Ⅲ（ TIANGE）；8 泳道：PCR 產(chǎn)物純化并濃縮 20 倍之后下依次是 4500 bp、3000 bp、2000 bp、1200 bp、800 bp、500ome of CP4; lane 2: Marker Ⅲ(TIANGE); b: lane 3-6: PCR pro12 mer (6.6 μL) and 10 mer (10 μL), 15 mer (6.6 μL) and 14 m mer (16.6 μL); lane 7 and 9: Marker Ⅲ(TIANGE); c: lanurified PCR products. The band size of DNA marker Ⅲ is 450800 bp, 500 bp, 200 bp, respectively.

圖 3-2 轉(zhuǎn)化子在 含 3 g/L 糠醛的 RM 培養(yǎng)基里的生長(zhǎng)評(píng)價(jià)Figure 3-2 Growth curves of transformants in RM with 3 g/L furfural.2 以 F2-1 為出發(fā)菌株的第二輪全基因組改組經(jīng)第一輪改組在含 2 g/L 糠醛的 RM 固體平板上篩選出耐受糠醛。為了進(jìn)一步提高 F2-1 的糠醛耐受性，進(jìn)行了第二輪的全基因組2-1 的基因組，以其基因組為模板，利用最佳隨機(jī)引物組合 15 mer (er (10 μL), 12 mer (16.6 μL)進(jìn)行易錯(cuò) PCR，，易錯(cuò) PCR 產(chǎn)物濃縮 20運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 F2-1 的感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇 16 h，將菌液適當(dāng)稀釋糠醛濃度為 2.3 g/L、2.5 g/L 和 2.7 g/L 的 RM 平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)菌落直徑較大的轉(zhuǎn)化子，預(yù)培養(yǎng)后在 3 g/L 糠醛，4 mL（25 mL 螺旋M 培養(yǎng)基初步篩選，獲得了 6 個(gè)生長(zhǎng)好于野生型的轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步轉(zhuǎn)化子在 100 mL 含 3 g/L 糠醛的 RM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。18 h 后，轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ223.122;TQ920.6

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本文編號(hào)：2651854